Modares Journal of Biotechnology
زیستفناوری مدرس
JMBS
Medical Sciences
http://biot.modares.ac.ir
1
admin
2322-2115
2476-6917
fa
jalali
1396
10
1
gregorian
2018
1
1
9
1
online
1
fulltext
fa
تولید رده نوترکیب HEK293T با بیش- بیانی پایدار miR-1 بهعنوان مدل زیستی برای مطالعات قلبی
Production of Recombinant HEK293T with miR-1 Overexpression as a Biological Model for Cardiac Studies
<span style="font-family:iransharp;"><strong><span style="font-size:10.0pt;">اهداف: </span></strong><span style="font-size:10.0pt;">القای مصنوعی بیش- بیان </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">miRNA</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> راهکار مناسبی برای القای موثرتر تمایز سلولی است. نقش موثر </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">miR-۱</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> در تکوین و تمایز سلولهای قلبی گزارش شده است. لنتیویروس یک ناقل کارآمد برای تهیه ردههای سلولی پایدار است. هدف پژوهش حاضر تولید رده سلولی با بیش- بیان پایدار </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">miR-۱</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> برای ایجاد یک مدل زیستی برای مطالعات قلبی بود.</span><br>
<strong><span style="font-size:10.0pt;">مواد و روشها:</span></strong> <span style="font-size:10.0pt;">در پژوهش تجربی حاضر، سلولهای </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">HEK ۲۹۳T</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> در محیط کشت </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">DMEM</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> بههمراه سرم جنین گاوی </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">(FBS)</span></span> <span style="font-size:10.0pt;">۱۰% و ال- گلوتامین ۲میلیمولار و پنیسیلین- استرپتومایسین </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">۱X</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> در محیط انکوباتور کشت داده شدند. پس از کلونکردن ژن </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">miR-۱</span></span><span style="font-size:10.0pt;">، کلونهای نوترکیب انتخاب شدند و حضور قطعه ژنی در وکتور نوترکیب با توالییابی تایید شد. وکتور حامل </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">miR-۱</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> بههمراه وکتورهای کمکی در سلول</span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">HEK۲۹۳T</span></span> <span style="font-size:10.0pt;"> بهصورت ویروس نوترکیب بستهبندی شد. تراآلایی سلولهای </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">HEK۲۹۳T</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> با ویروس نوترکیب برای تولید رده پایدار انجام شد. سپس کارآیی تراآلایی و رقت موثر ویروس با نشانگر </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">GFP</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> سنجش شد. تغییرات بیان </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">miR-۱</span></span> <span style="font-size:10.0pt;">با روش </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">qPCR</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> بررسی شد. تحلیل دادهها از طریق بررسی مقایسهای چرخه آستانه و روش </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">Pfaffl</span></span> <span style="font-size:10.0pt;">انجام گرفت.</span><br>
<strong><span style="font-size:10.0pt;">یافتهها:</span></strong><span style="font-size:10.0pt;"> بیشترین میزان بیان </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">GFP</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> مربوط به سلولهای آلودهشده با رقت ۱۵۰میکرومولار بود. نشانگر فلورسنت </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">GFP</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> موجب تسهیل فرآیند بهینهسازی و تخلیص سلولهای نوترکیب شد. در ارزیابی </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">qPCR</span></span><span style="font-size:10.0pt;">، بیان </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">miR-۱</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> در سلولهای تراآلایی شده در مقایسه با سلولهای گروه کنترل افزایش قابل ملاحظهای داشت.</span><br>
<strong><span style="font-size:10.0pt;">نتیجهگیری: </span></strong><span style="font-size:10.0pt;">رده سلولی پایدار نوترکیب </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">HEK۲۹۳T</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> بیش- بیانکننده </span><span dir="LTR"><span style="font-size:8.0pt;">miR-۱</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> در لنتیویروس، بهعنوان مدل زیستی مناسب برای بررسی فرآیندهای تکامل و تکوین قلب است.</span></span>
<strong>Aims: </strong>The induction of artificial over-expression of miRNAs is an appropriate approach to more effective cell differentiation. The significant role of microRNA-1(miR-1) has been reported in the development and differentiation of cardiac cells. Lentivirus is an effective vector for stable cell line production. The aim of this study was the production of recombinant HEK293T with miR-1 overexpression as a biological model for cardiac studies.<br>
<strong>Materials & Methods:</strong> In this experimental study, HEK 293T cells were cultured in DMEM medium with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and L-glutamine 2mM and Penicillin-Streptomycin 1X in incubator medium. After cloning of miR-1 gene, recombinant clones were selected and the recombination was confirmed by sequencing. The miR-1 carrying vector and auxiliary vectors were packaged in the HEK293T to produce the recombinant virus. The infection of HEK293T by recombinant virus was performed in order to achieve stable cell line. Then, GFP fluorescent marker evaluated the efficiency of transfection and effective virus dilution. Finally, the alteration in expression level of miR-1 was assessed by qPCR. Data analysis was performed by comparing the threshold cycle and Pfaffl method.<br>
<strong>Findings:</strong> The most GFP expression was detected in transfected cells by 150 micromole dilution. GFP fluorescent marker facilitated optimization and purification of recombinant cells. qPCR investigation demonstrated the significant increase in expression of miR-1 in transfected cells in comparison to controls.<br>
<strong>Conclusion:</strong> The stable recombinant HEK293T miR-1 over-expressing cell line in lentivirus can be utilized as a suitable biological model for investigation of cardiac evolution and development processes.
microRNA-1, سلولهای HEK293T, تمایز سلولی, تراآلایی ویروسی سلول, مدل زیستی
MicroRNA-1, HEK293, Cell Differentiation, Viral Cell Transformation, Biological Model
1
8
http://biot.modares.ac.ir/browse.php?a_code=A-22-20160-1&slc_lang=fa&sid=22
M.
Rasekhi
مهسا
راسخی
100319475328460080826
100319475328460080826
No
National Institute of Genetic Engineering & Biotechnology, Tehran, Iran
پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
B.
Bakhshande
بهناز
بخشنده
b.bakhshandeh@ut.ac.ir
100319475328460080827
100319475328460080827
Yes
Biotechnology Department, Science Faculty, University of Tehran, Tehran, Iran
گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم، دانشگاه تهران، تهران، ایران
M.
Sadeghizadeh
مجید
صادقی زاده
100319475328460080828
100319475328460080828
No
Genetic Department, Biological Sciences Faculty, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
A.
Salimi
علی
سلیمی
100319475328460080829
100319475328460080829
No
Nanobiotechnology Research Center, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran
مرکز تحقیقات نانوبیوتکنولوژی، دانشگاه علوم پزشکی بقیهاله(عج)، تهران، ایران
M.
Soleimani
مسعود
سلیمانی
100319475328460080830
100319475328460080830
No
Hematology Departmen, Medical Sciences Faculty, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه هماتولوژی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران