زیست فناوری

چکیده پرتوسیس توکسین مهمترین عامل ویرولانس باکتری Bordetella pertussis است که از نوع اگزوتوکسین های پروتئینی AB5 می باشد و آنتی ژن محوری درساخت واکسن های غیر سلولی سیاه سرفه است. به دلیل ملاحظات اقتصادی روشهای تخلیص پرتوسیس توکسین بطور کامل منتشر نشده است. هدف از این تحقیق، راه اندازی و اصلاح روش تخلیص پرتوسیس توکسین از مایع رویی کشت باکتری و زیست سنجی آن توسط آزمون CHO-cell بود. سویه واکسینال ۵۰۹ B. pertussis و سلول CHO از موسسه رازی تهیه گردید. کشت باکتری در فرمانتور 300 لیتری در دمای 35 درجه سانتیگراد و در محیط B2 به مدت 44 ساعت صورت پذیرفت. سپس مایع رویی جدا سازی گردیده و به ترتیب با فیلتر 45/0 میکرومتر تصفیه گردید و سپس با دستگاه اولترافیلتراسیون (cut off 10 kDa) تغلیظ شد. تخلیص توکسین توسط کروماتوگرافی میل ترکیبی با فتوئین سفاروز انجام گردید. پس از اعمال توکسین تخلیص شده بر منولایر سلولی CHO، فرایند خوشه ای شدن سلول ها از ساعت نخست پدیدار گردید و در مشاهدات ساعت دوازدهم به بعد متوقف شد. میزان توکسین تخلیص شده IU/ml 43/0 ±۵۳/۲ محاسبه گردید. طی تولید واکسن های سلولی، پس از جدا سازی جرم سلولی، فاز مایع دور ریخته می شود، حال آنکه نتایج بررسی حاضر نشان داد این فاز محتوی مقادیر قابل توجه توکسین می باشد. با توجه به آنکه استحصال پرتوسیس توکسین، رکن اصلی در توسعه و ساخت واکسن های نوین غیر سلولی است لذا تحقیقات تکمیلی در خصوص استفاده از سایر سویه ها و بررسی شرایط مختلف کشت باکتری پیشنهاد می شود.

چکیده خلاصه مقدمه: ویروس سرخک عضو خانواده پارامیکسو ویروسها و از جنس موربیلی ویروسها است که دارای ژنوم RNA با قطبیت منفی است. روش: در این طرح ابتدا اقدام به استخراج RNA از محیط حاوی ویروسهای سرخک سوش واکسینال AIK-C که روی سلولهای MRC-5 رشد کرده بودند٬ گردید.RNA استخراج شده فورا " جهت ساخت cDNA تک رشته ای با استفاده از واکنش نسخه برداری معکوس مورد استفاده قرار گرفت. cDNA تک رشته ای بعنوان رشته الگو جهت تکثیر ژن F بوسیله پرایمرهای اختصاصی در واکنش PCRاستفاده شد. محصول PCR با طول مورد نظرbp 1662 درون وکتورهای بیانی pET-28a(+) و pET-22b(+) کلون گردید. جهت تایید کلونینگ٬ پلاسمیدهای نوترکیب بدرون سلولهای مستعد E.coli DH5α ترانسفورم شدند وکلونیهای بدست آمده با استفاده از PCR مستقیم غربالگری شدند. سپس پلاسمیدهای نوترکیب بروش لیز قلیایی استخراج شدند یافته ها: هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از آنزیمهای محدود الاثر Nde I وHindIII انجام گرفت که قطعه DNA بطول bp 1662 جداسازی شد. پلاسمید نوترکیب pET-28aF توسط شرکت MWG آلمان تعیین توالی شد. مقایسه این توالی با توالی ژن F ویروس سرخک از بانک ژن (سوش واکسینال ادمونستون (AIK-C) با Accession number : AF266286) انجام گرفت و همولوژی بالایی برای این ژن مشاهده گردید. نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان داد ژن F بسیار حفاظت شده و پایدار است. این پایداری باعث اهمیت بررسی این ژن در تهیه واکسن نوترکیب شده است.