زیست فناوری

چکیده فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tPA)، پروتئینی با وزن مولکولی 65 کیلودالتون و از خانواده سرین پروتئازهاست. این پروتئین به طور طبیعی و با مقیاس کم توسط سلولهای اندوتلیال عروق ترشح می شود و تبدیل شدن پلاسمینوژن به پلاسمین و حل شدن لخته های خونی را به عهده دارد. این پروتئین به طور تزریقی در زمان حملات قلبی جهت رفع لخته خونی تجویز می شود. یکی از مشتقات این پروتئین به نام"رتپلاز" نسخه ای جهش یافته از فعال کننده پلاسمینوژن انسانی است که 137 اسید آمینه آن حذف شده است. این دارو در باکتری اشریشیا کلی بیان می شود و فاقد تغییرات پس از ترجمه از جمله گلیکوزیلاسیون می باشد. به دلیل وجود نه باند دی سولفید، بیان این پروتئین در سیستم باکتریایی دارای مشکلات بسیار است و اغلب منجر به ایجاد توده های پروتئینی غیر محلول (inclusion body) می شود. خوردگی مجدد و تبدیل پروتئین غیر فعال به فرم فعال آن فرآیندی طولانی و دشوار است و برای پروتئین های دارای ساختار پیچیده و باندهای دی سولفید متعدد، بازده پایینی دارد. در گزارش حاضر با تغییر ترادف تنظیمی، فرم محلول و فعال آنزیم رتپلاز در باکتری اشریشیاکلی BL21 تولید شده است. بیان القایی رتپلاز تحت کنترل پروموتر T7 منجر به رسوب پروتئین در داخل سلول گردید در حالیکه استفاده از یک پروموتر دایمی با قدرت کمتر، فرم فعال آنزیم را در سیتوزول ایجاد نمود.

چکیده لنتی ویروسها از جمله موثرترین ویروسهای نوترکیب برای انتقال ژن به سلولها و بافتهای پستانداران بشمار میرود. این مطالعه شامل دو بخش اساسی است: (1) بررسی کارائی ستونهای پروتئینی در تولید لنتی ویروسهای نوترکیب با تیتر بالا و (2) بکارگیری این ستونها درتولید لنتی ویروسهای نوترکیب حامل ژن فاکتورنوروتروفیک GDNF. در بخش اول مطالعه با استفاده از دو ناقل انتقال (حامل GFP یا Jred) تولید لنتی ویروس نوترکیب کردیم. با انتقال سوپرناتان سلولهای ترانسفکت شده به ستونهای پروتئینی Amicon و سانتریفوژ ستونها بیش از 99% سوپرناتان را جدا کردیم تا استوکی در حجم 500 μl از سوپرناتان غلیظ شده و مملو از ویریونها بدست آید. با افزودن رقتهای مختلف این استوک ویروسی به سلولهای هدف، ترانسدوکشن سلولی با موفقیت انجام شد بطوریکه ترانسژنهای گزارشگر در 100% سلولها مشاهده شد. متقابلا تست بخش رقیق سوپرناتان منجر به هیچگونه بیان ژن که نشانگر فعالیت ویروسی باشد نگردید. تولید تیتر بالای ویروسی با روش فیلتراسیون مزبور برای انتقال موفقیت آمیز ژنها اهمیت دارد و از نظر هزینه، حجم کار و زمانبری بر آنها ارجحیت دارد. در بخش دوم این مطالعه، توالی مربوط به فاکتور مهم GDNF را به سازه لنتی ویروسی پیوند زده و به همان روش بالا ویروسهای تیتر بالا تولید کردیم. با انتقال این ویروسها به آستروسیتهای انسانی توانستیم افزایش بیان ژن GDNF را در سطح mRNA بمیزان 3 برابر بدست آوریم. این نتایج نشان دادکه لنتی ویروسهای حامل GDNF را میتوان با روش جاری در تیتر بالا تولید کرده و برای مطالعات تمایزی و حفاظت نورونی مورد استفاده قرار داد.