زیست فناوری

چکیده تولید پروتئینهای نوترکیب در میزبان باکتریایی ای کلای در چند دهه اخیر بسیار رواج پیداکرده است. مطالعات و آزمایشهای بسیار زیادی در زمینه بهینه سازی و افزایش تولید و بیان پروتئینهای نوترکیب در این میزبان انجام گرفته است. از راههای افزایش تولید، رسیدن به تراکم بالای سلولی (افزایش غلظت سلولی) و به طبع آن تولید بیشتر پروتئینهای داخل سلولی ازجمله پروتئین نوترکیب –NGF βمیباشد. بدین منظور در این پژوهش برای اولین بار با استفاده از گلیسرول و عصاره مخمر به عنوان منابع کربن و نیتروژن و همچنین نمک MgCl2 به عنوان افزایش دهنده رشد، کشت باکتری در تراکم سلولی بالا انجام شد. همچنین تأثیر شرایط کشت شبانه بر رشد باکتری مورد بررسی قرار گرفت. بهینه شرایط با استفاده از روش سطح پاسخ به دست آمد که شامل غلظت 18/23 گرم بر لیتر گلیسرول، غلظت 14/44 گرم بر لیتر عصاره مخمر و غلظت mM 10 نمک MgCl2 میباشد. همچنین کشت 14 ساعته در دمای 37 درجه سانتی گراد و دور شیکرrpm 180 به عنوان شرایط بهینه رشد معرفی شد. ایﻦ ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ ﻧﺸﺎن داد ﮐﻪ میزان رشد سلولی و ﺗﻮﻟﯿﺪ پروتئین نوترکیب –NGF β در ﺷﺮایﻂ بهینه شده ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﻣﺤﯿﻂ ﮐﺸﺖ ﭘﺎیﻪ اﻓﺰایﺶ قابل توجهی داﺷﺘﻪ اﺳﺖ.

چکیده پروتئین اکتیوینA متشکل از دو دایمر βA بصورت یک پری-پرو-پروتئین با طول 426 آمینواسید سنتز می شود که پس ازحذف بخشهای پری و پرو، پروتئین بالغ با طول 116 آمینواسید حاصل می‌شود. این پروتئین که اولین بار از مایع فولیکولی گوسفند بعنوان یک محرک قدرتمند برای تولید هورمون FSH جداسازی شد، دارای عملکردهای گوناگونی مثل حفظ و بقای سلول های عصبی، آپوپتوز، رشد و تمایز در انسان می باشد. از آنجاییکه پروتئین اکتیوینA دارای کاربردهای متعددی در زمینه پزشکی مانند تمایز سلول های بنیادی، ترمیم زخم، درمان بیماری های تحلیل عصبی مانند آلزایمر و ...است برای اولین‏بار در این تحقیق در سه سویه‏ی متفاوت باکتری E.coli بیان شد. از آنجاییکه پروتئین مذکور در ساختار فعال و عملکردی خود دارای پیوندهای دی‏سولفیدی است، محیط احیا کننده‏ی سیتوپلاسم E.coli برای بیان آن مناسب نمی‌باشد لذا، محیط اکسید کننده‌ی پری‏پلاسم جهت تولید آن همراه با تاخوردگی صحیح مورد توجه قرار گرفت. در این تحقیق، cDNA ژن اکتیوین A انسانی بدست آمده از بانک اطلاعاتی NCBI پس از بهینه‌سازی رمزه به همراه پپتید نشانه تغییریافته آنزیم آلفا آمیلاز باکتری باسیلوس لیکنی فورمیس بومی ‌ایران در وکتور بیانی pET21b(+)، ساب کون و سپس به روش ترنسفورماسیون به سویه‌های BL21(DE3)pLysS ،BL21(DE3)Rosetta gami و BL21(DE3) انتقال یافت. پس از بیان همزمان با استفاده از القاگر IPTG ، محتوای پروتئینی استخراج شده از هر سه سویه‏ با استفاده از تکنیکهای SDS-PAGE ، دات بلات و وسترن بلات با یکدیگر مقایسه گردید. نتایج نشان دهنده بیان در هر سه سویه باکتریایی بویژه در Rosetta gamiو DE3 می باشد.

چکیده تولید پروتئین های نوترکیب بطورمثال β-NGF با استفاده از میزبان های پروکاریوتی موضوع بسیاری ازمطالعات چنددهه اخیر می باشد. با وجود اینکه محیط های کشت باکتریایی نسبت به محیط کشتهای مخصوص سلول های یوکاریوتی ارزان تر و مقرون به صرفه تر می باشند اما وقتی همین محیط ها در مقیاس های صنعتی استفاده می شوند هزینه گزافی را به شرکت های زیست فناور تحمیل می نمایند. لذا یافتن محیط کشتی ارزان قیمت و دردسترس که باکتری های نوترکیب در آن قادر به رشد و تولید پروتئین های نوترکیب باشند از اهم بسیاری تحقیقات می باشد. درمطالعه حاضر برای اولین بار از مخلوط شیره خرما و عصاره مخمربه عنوان محیط کشتی ارزان قیمت استفاده شد. در بررسی RSM (response surface methodology) از غلظت های مختلف شیره خرما و عصاره مخمر به عنوان منابع کربن و نیتروژن مورد نیاز برای رشد باکتری ها استفاده شد و نشان داده شد که بالاترین میزان رشد در غلظت g/lit 20 و 5 کربن و نیتروژن می باشد. همچنین نشان داده شد که باکتری ها در این محیط علاوه بر رشد، قادر به تولید پروتئین نوترکیب (بطور مثال β-NGF) نیز می باشند.