زیست فناوری

چکیده آنزیم اندوگلوکاناز Cel9A از باکتری آلیسیکلوباسیلوس اسیدوکالداریوس (AaCel9A) یک آنزیم گرمادوست بوده و پیوندهای بتا 1 به 4 را در مولکول سلولز به طور اتفاقی هیدرولیز کرده و الیگوساکاریدهایی با سرهای احیا کننده تولید می‌کند. در این تحقیق ابتدا وکتور pDEST17 حاوی ژن آنزیم AaCel9A جهت بیان پروتئین نوترکیب به میزبان مناسب (اشریشیا کلی سویه BL21) منتقل شده و بعد از بیان، با استفاده از ستون نیکل آگارز خالص گردید. سپس با توجه به تاثیر گذاری pH، دما و کلسیم بر روی فعالیت و پایداری آنزیم، با استفاده از این سه متغییر فعالیت آنزیم با استفاده از روش رویه پاسخ بهینه گردید. نتیجه الکتروفورز ژل SDS-PAGE نشان داد که آنزیم نوترکیب در حدود 59 کیلو دالتون وزن مولکولی داشته و به خوبی بیان و خالص شده است. نتایج روش رویه پاسخ نشان داد که تاثیر pH بر روی فعالیت آنزیم بیشتر از دما، و دما بیشتر از کلسیم بوده و بهینه شرایط فعالیت آنزیم AaCel9A در محیط با 35/6 pH، دمای°C5/64 و غلظت کلسیم برابر با 92/4 مولار است. در نهایت با توجه به همبستگی بالای نتایج آزمایشگاهی و نتایج پیش بینی شده می توان گفت مدل پیشنهادی در این تحقیق برای پیش بینی شرایط بهینه فعالیت آنزیم از صحت بالایی برخوردار است.

چکیده سلولاز آنزیمی پرکاربرد در صنایع مختلف می باشد. تثبیت سلولاز یکی از روش‌های پایدارسازی آن است که نه تنها امکان جداسازی آنزیم از واکنش، بلکه امکان استفاده مجدد از آن را فراهم می‌سازد و در نتیجه هزینه استفاده آنزیم در صنعت به طور قابل توجهی کاهش می‌یابد. استفاده از کیتوزان به عنوان بستر جهت تثبیت آنزیم و استفاده گسترده آن در فرآیند‌های صنعتی همواره مورد توجه بوده است. ویژگی‌های فوق العاده از جمله زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری و غیر سمی بودن آن، کیتوزان را بستری مناسب جهت فرآیند تثبیت معرفی می‌کند. در این مطالعه توالی ژنی کد کننده آنزیم اندوگلوکاناز AaCel9A در وکتور بیانی pET28a(+) همسانه سازی شد. نتایج حاصل از تعیین توالی مؤید قرارگیری صحیح قالب ژنی AaCel9A در وکتور بود. سپس وکتور حاوی ژن به سلول های مستعد اشریشیا کلی سویه BL21 منتقل شده و بیان پروتئین در آن ها القا شد. بیان آنزیم با استفاده از روش الکتروفورز SDS-PAGE و سنجش فعالیت آنزیم تایید و با ستون نیکل آگارز تخلیص بعمل آمد. ساخت ماکروبیدهای کیتوزان با روش ژله ای شدن صورت گرفت. مولکولهای آنزیم با استفاده از لینکرهای گلوتارآلدئیدی به صورت کووالان به بستر متصل و تایید تثبیت آنزیم توسط FTIR و نیز سنجش فعالیت آنزیمی از ماکروبیدهای حاوی آنزیم انجام پذیرفت. آنالیز نتایج نشان داد که بهترین شرایط برای تثبیت کوالان آنزیم بر روی بستر در غلظت گلوتارآلدئید 7/0% و بافر سدیم فسفات (7 pH) می باشد. همچنین آنالیز برادفورد و سنجش فعالیت آنزیمی مؤید تثبیت 85% از مولکول‌های آنزیم برروی بستر بود.