زیست فناوری

چکیده مقدمه: امروزه ترمیم بافت استخوانی با افزایش اختلالات و آسیب‌های استخوانی از اهمیت خاصی برخوردار است. مهندسی بافت استخوان، راهکارهای ویژه‌ای را برای رفع این مشکلات فراهم کرده است. مطالعه حاضر با هدف تخلیص فیوژن پپتید نوترکیب حاوی تگ تمایلی به هیدروکسی‌آپاتیت با کمک ستون کروماتوگرافی سرامیکی انجام شد.
مواد و روش‌ها: در مطالعه حاضر، نوعی پپتید فیوژن طراحی شد که از یک‌سو حاوی توالی دمین اتصالی به هپارین بود که می‌تواند به انواع مختلفی از فاکتورهای رشد دخیل در ترمیم بافت متصل و باعث به‌دام‌انداختن این فاکتورها در محل ضایعه شود و از سوی دیگر حاوی یک تگ بود که شامل توالی به‌دست‌آمده از یک مطالعه آزمایشگاهی مبتنی بر بیان فاژی است. علت قراردادن این تگ، اتصال پپتید به داربست حاوی هیدروکسی‌آپاتیت و تخلیص پپتید نوترکیب توسط ستون هیدروکسی‌آپاتیت بود. بنابراین توالی ژن برای بیان در میزبان پروکاریوتی E. coli ﺳﻮﻳﻪ BL۲۱ بهینه‌سازی و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزیم‌های SacI و BamHI در وکتور بیانی pET-۲۱a(+) ساب‌کلون شد. بیان پپتید نوترکیب از طریق روش‌های SDS-PAGE و وسترن‌بلات بررسی شد. برای بهینه‌کردن شرایط تخلیص، با اعمال تغییرات اساسی در روش کار اصلی شرکت سازنده، تخلیص دو مرحله‌ای انجام شد. این پپتید با تمایل بالایی به ستون متصل و با خلوص قابل قبولی تخلیص شد. در نهایت وجود تجمعات پپتیدی از طریق روش DLS بررسی شد.
یافته‌ها: نتایج کلونی PCR، هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم‌های SacI و BamHI و تعیین توالی حاکی از صحت فرآیند کلونینگ بود. از طرفی بیان پپتید فیوژن توسط روش‌های SDS-PAGE و وسترن‌بلات تایید و مهاجرت آن روی ژل باعث ظاهرشدن باندی در حدود ۱۲کیلودالتون شد. تغییرات ایجادشده در روش کار شرکت سازنده باعث شد فرآیند تخلیص به‌صورت مطلوبی انجام شود و در نهایت نتایج روش DLS هم خلوص پپتید تخلیص شده را نشان داد.
نتیجه‌گیری: نتایج نشان‌دهنده بیان مطلوب و خلوص قابل توجه پپتید فیوژن طراحی‌شده در این مطالعه است.

چکیده اهداف: آنزیم ماتریکس متالوپروتئیناز ۹ در پیشرفت روند بسیاری از بیماری‌ها مانند پریودنتیت، آترواسکلروزیس و سرطان‌ها نقش بسزایی دارد. یکی از روش‌های پایداری آنزیم استفاده از حلال‌های فرازودگداز است. هدف این پژوهش، بررسی اثر حلال فرازودگداز روی پایداری و ساختار آنزیم ماتریکس متالوپروتئیناز ۹ با هدف درمانی بود.
مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر، آنزیم ماتریکس متالوپروتئیناز ۹ فرم فعال (۷۰۷-۱۰۷ توالی رزیدوی آمینواسیدی) با استفاده از وکتور بیانی pET۲۱a در باکتری اشریشیا کلی سویه BL۲۱ بیان و تخلیص و ریفولدینگ آنزیم توسط روش گرادیان شیب اوره به‌طور همزمان روی ستون نیکل سفارز انجام شد. سپس تاثیر حلال فرازودگداز بر پایه کولین‌کلراید و گلیسرول با نسبت مولی ۱:۱ بر فعالیت، پایداری و ساختار آنزیم ماتریکس متالوپروتئیناز ۹ بررسی شد. فعالیت آنزیم در غلظت‌های مختلف ژلاتین در حضور حلال‌های فرازودگداز ۱۵ و ۳۰% حجمی/حجمی در ۷/۸=pH برای به‌دست‌آوردن Vmax و km با رسم نمودار میکائیلیس- منتن و استفاده از نرم‌افزار Prism version ۵.۰ مورد بررسی قرار گرفت.
یافته‌ها: با افزایش درصد حلال‌ها تا ۳۰%، فعالیت ویژه آنزیم افزایش یافت و پس از آن روند کاهشی داشت و در حضور حلال ۳۰% حجمی/حجمی در دو دمای ۵۰ و ۶۰º​C در مقایسه با حلال ۱۵% و عدم حضور حلال دارای فعالیت باقیمانده بیشتری بود. نتایج نشان‌دهنده پایداری بیشتر آنزیم در حلال ۳۰% بود.
نتیجه‌گیری: آنزیم ماتریکس متالوپروتئیناز ۹ در حضور حلال فرازودگداز ۳۰% حجمی/حجمی بر پایه کولین‌کلراید و گلیسرول دارای بیشترین فعالیت و پایداری است. افزایش پایداری حرارتی آنزیم را می‌توان به فشردگی ساختار آن در حضور حلال فرازودگداز نسبت داد.