زیست فناوری

چکیده فاکتور رشد عصبی (NGF) یک فاکتور نوروتروفیک عصبی می­ باشد که در حفظ، بقاء و تمایز سلول­های عصبی مرکزی و محیطی فعالیت دارد. این پروتئین سه زیرواحدی بوده که زیرواحد بتای آن دارای فعالیت اصلی است. براساس تحقیقات، به نظر می­رسد که می­توان از این فاکتور در درمان بسیاری از بیماری­ها از جمله نوروپاتی­­های محیطی در ارتباط با دیابت، آلزایمر، پارکینسون، بیماری­های پوستی و غیره استفاده کرد. به دلیل فضای اکسیداتیو پری پلاسم، بیان پروتئین نوترکیب NGF در میزبان پروکاریوتی باید در پری­ پلاسم صورت گیرد. شایان ذکر است که بیان هم­زمان چپرون­های سیتوپلاسمی، می تواند ترشح پروتئین­های نوترکیب به فضای پری­پلاسمی را تسهیل کرده و سبب افزایش حلالیت آن­ها ­شود.
در این تحقیق تاثیر چپرون های سیتوپلاسمی GroEL/GroES، DnaK/DnaJ،GrpE ، Trigger Factor(TF) بر میزان تولید پری پلاسمی پروتئین نوترکیب NGF مطالعه گردید. بدین منظور زیرواحدβ-NGF در وکتور بیانی pET39b(+) بصورت هم­زمان با پلاسمیدهای چپرونی pG-Tf2، pTf16، pGro7،pKJE7 و pG-KJE8 در باکتری E. coli سویه DE3 بیان شد.
نتایج بدست­ آمده نشان دادند که در حضور چپرون ) TFپلاسمید چپرونی pTf16 ) تولید کل محتوای پروتئینی و پروتئین های پری­ پلاسمی افزایش داشته ­است. همچنین مجموع چپرون های DnaK/DnaJ و GroEL/GroES(پلاسمید چپرونی pG-KJE8 ) نیز تا حدودی سبب افزایش تولید شده اند، در حالی­که بیان هر یک از چپرون های GroEL/GroES(پلاسمید چپرونی pGro7) و یا DnaK/DnaJ (پلاسمید چپرونیpKJE7) تأثیری بر بیان پروتئین نداشته اند. نتایج کشت سلول نیز نشان دهنده فعال بودن پروتئین تولیدی بوده و تمایز سلول ها به سلول­های عصبی را نشان می دهد.

چکیده اکتیوین A یکی از اعضای خانواده‌ی فاکتور رشد تغییردهنده‌ی بتا (TGF-β) است که نقش مهمی در فرآیندهای فیزیولوژیکی متعدد همانند تمایز سلولی، ترمیم بافتی، رگ زایی، تمایز سلول های بنیادی، چسبندگی سلولی و آپوپتوز دارد. لذا با توجه به کاربردهای بالینی متعدد این پروتئین، تولید نوترکیب آن سودمند می‌باشد.از آنجاییکه اشرشیاکلی یکی از محبوب ترین میزبان ها برای تولید پروتئین‌های نوترکیب است، در این تحقیق از بیان سیتوپلاسمی در این سویه به منظور تولید مقادیر بالایی از اکتیوین A استفاده گردید. بدین منظورابتدا cDNA ناحیه‌ی بالغ ژن اکتیوین A تکثیر و در وکتور (+)pET28a کلون گردید. وکتور حاصل به سویه‎های (DE3)BL21، plysS(DE3)BL21 و Rosetta gami (DE3)BL21 انتقال داده شد. پس از القای پروموتر با استفاده از IPTG و بیان پروتئین، تولید اکتیوین A به وسیله‌ی روش های SDS-PAGE و وسترن بلات تایید شد. نتایج نشان داد که بیان اکتیوین A در سیتوپلاسم هر سه سویه یک رویکرد موثر برای دست‌یابی به میزان بالایی از پروتئین نوترکیب است اما در این بین، سویه (DE3)BL21 مقدار بیشتری پروتئین تولید کرده است. در مرحله ی بعد به منظور دست یابی به شکل محلول اکتیوین A از بیان همزمان چپرون‌های سیتوپلاسمی TF، GroEL/ES و DnaK/J با وکتور (+)pET28a که حامل اکتیوینA بود استفاده شد. نتایج SDS-PAGE و وسترن بلات نشان داد که بیان همزمان اکتیوین A با استفاده از پلاسمید چپرونی pGro7 که دارای چپرون های GroEL و GroES می‌باشد، در سویه‌ی(DE3)BL21 یک رویکرد مؤثر برای تولید پروتئین اکتیوین A محلول است.

چکیده پروتئین CD۸۰ به‌عنوان عضوی از ابرخانواده ایمنوگلوبولین‌ها، یک پروتئین تراغشایی است که در سطح سلول‌های ارایه‌کننده آنتی‌ژن (APC) بیان می‌شود. این پروتئین دارای دو گیرنده CTLA-۴ و CD۲۸ در سطح سلول‌های T است. بر اثر اتصال این پروتئین به این گیرنده‌ها به ترتیب مسیر مهاری و تحریکی در سلول‌های T آغاز می‌شود. در حالت طبیعی، پروتئین‌های CD۸۰ دارای تمایل اتصال بیشتری به CTLA-۴ نسبت به CD۲۸ هستند و این از عوامل خاموش‌کننده‌ سلول‌های T در سیستم ایمنی، به‌منظور جلوگیری از خودایمنی است. هدف از مطالعه حاضر، ایجاد واریانتی از پروتئین CD۸۰ است که دارای تمایل اتصال افزایش‌یافته به CD۲۸ است تا با قدرت بیشتری به این گیرنده متصل شود و مسیرهای تحریکی را بیشتر از نوع وحشی این پروتئین (پروتئین CD۸۰ اولیه) در سلول‌های T القا کند. برای شناسایی این واریانت ابتدا توالی وحشی با کمک محیط برنامه‌نویسی R، در جایگاه‌های ۳۱ و ۹۲ با اسیدهای آمینه‌ای که نقش مهمی در شکل‌گیری پیوندهای هیدروژنی دارند، جهش داده شد. ۱۰۰ توالی خروجی نرم‌افزار R، با سرور SWISS-MODEL مدل‌سازی شدند. سپس مدل‌های خروجی، به‌صورت تک‌تک با سرور HADDOCK داک شدند و در نهایت انرژی‌های اتصالی از جمله انرژی‌های الکترواستاتیک و واندروالسی بین گیرنده‌ها و لیگاندها محاسبه شدند. بین تمامی مدل‌های ساخته‌شده، توالی جهش‌یافته K۳۱Y, R۹۲F دارای بهترین انرژی الکترواستاتیک و واندروالسی است و در مقایسه با نوع وحشی پروتئین CD۸۰، با قدرت بالاتری به پروتئین CD۲۸ متصل می‌شود.

چکیده اهداف: فاکتور رشد عصبی β–NGF یک عامل درمانی مهم در درمان بسیاری از بیماری‌های تحلیل عصبی مثل آلزایمر است، لذا تولید نوترکیب آن در مقیاس انبوه از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. هدف از بررسی حاضر بهینه‌سازی فاکتورهای موثر در دست‌یابی به بیشترین میزان تولید پروتئین β–NGF در فرمانتور است.
مواد و روش‌ها: از آنجا که باکتری E. coli سویه بیانی مناسبی برای تولید در مقیاس صنعتی است، در مطالعه حاضر از سویه DE_۳ باکتری E. coli به‌منظور تولید پروتئین نوترکیب β–NGF استفاده شد. همچنین از بیوراکتور ۵لیتری به‌منظور تولید پروتئین استفاده شد و میزان اکسیژن محلول (DO%) و دمای پس از القا با استفاده از روش نرم‌افزار آماری سطح پاسخ (RSM) بهینه‌سازی شد. ابتدا تاثیر این دو متغیر بر میزان تولید پروتئین مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور در هر آزمایش کل محتوای پروتئینی استخراج و با روش برادفورد تعیین غلظت شد.
یافته‌ها: نتایج نشان داد که بهینه شرایط برای دست‌یابی به بیشترین میزان تولید پروتئین دمای پس از القای ºC۵/۲۸ و DO، ۳۰% است و در این شرایط غلظت پروتئین تولیدی ۶۱/۰±۶/۹میکروگرم بر میلی‌لیتر است. نهایتاً تاثیر این فاکتورها بر تولید پروتئین β–NGF با استفاده از روش دات‌بلات مورد ارزیابی قرار گرفت که نتایج نشان‌دهنده بیشترین میزان تولید در شرایط بهینه‌سازی‌شده است.
نتیجه‌گیری: به‌طور کلی می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که میزان DO% و دمای پس از القا علاوه بر تاثیر بر رشد باکتری نوترکیب E. coli در بیوراکتور، بر میزان تولید و بیان پروتئین های نوترکیب (مثل β–NGF) نیز تاثیر مستقیمی دارد.