زیست فناوری

چکیده امروزه، مهندسی بافت استخوان راه­کارهای ویژه­ای جهت ترمیم بافت استخوانی بواسطه ترکیب مواد زیستی به همراه یک داربست، جهت فراهم سازی سلول­های مناسب جهت استخوان­سازی و فاکتورهای رشد به وجود آورده است. در این تحقیق، با روش­های بیوانفورماتیکی پپتید فیوژنی طراحی شد که می تواند به فاکتورهای رشد دخیل در ترمیم بافت استخوان متصل و منجر به به دام انداختن این فاکتورها در محل ضایعه ­گردد. در این مطالعه در پپتید طراحی شده دمین متصل شونده به هپارین قرار داده شد و این پپتید با کمک داکینگ با فاکتور رشد در حالت های مونومر و دایمر کمپلکس گردید. ساختارهای کمپلکس بر اساس کمترین امتیاز حاصل شده که به ترتیب شامل 1117- و 912.5- بود انتخاب شدند. با توجه به نتایج داکینگ و شبیه سازی دینامیک مولکولی، این فیوژن پپتید قادر به اتصال به فاکتور رشد پروتئین های مورفوژنتیک استخوان می­باشد. بر اساس نتایج شبیه سازی برخلاف پپتید در حالت مونومر، تغییرات نمودار RMSD کمپلکس پپتیدی در حالت دایمر بعد از 10 نانو ثانیه از زمان شبیه­سازی به ثبات رسیده و تا پایان شبیه­سازی ثبات خود را حفظ کرده است. این نتایج نشان می دهد که کمپلکس حاصل در حالت دایمر در اتصال به فاکتور رشد با توجه به بررسی میزان فاکتور RMSD دارای الگوی بهتری از پایداری نسبت به حالت مونومر می باشد.

چکیده چکیده
فرآیند ترمیم زخم، یک فرآیند پیچیده و پویا است که انواع سلول­ها و مسیرهای متابولیکی را مختلف را درگیر می­کند. این فرآیند از سه فاز التهابی، تکثیر سلولی و بازسازی بافتی تشکیل شده است. بهبود موفقیت آمیز زخم به تنظیم دقیق و هماهنگی بین عوامل درگیر بستگی دارد. تا سال­های اخیر استراتژی درمان­های زخم­های مزمن به آماده­سازی زخم، برداشتن بافت نکروزه شده، کنترل عفونت و التهاب محدود می­شد اما اخیرا استفاده از فاکتورهای رشد در جهت تسریع روند درمانی و بهبود زخم تایید شده­اند. از اولین انواع فاکتورهای رشد نوترکیب که در درمان زخم­های دیابتی به تایید رسیده است، فاکتور رشد نوترکیب انسانی PDGF-BB می‌باشد. مطالعات مختلف گزارش کرده است که PDGF به عنوان یک واسطه ی مهم در بهبود زخم در تسریع بهبودی، بهبود التهاب، تکثیر سلولی، رگزایی و بازسازی بافت کمک می­کند. در این مطالعه، توالی ژن PDGF-B انسانی، جهت کلون کردن در وکتور بیانی pET 21(a+) قرار گرفت و سپس برای بیان آن در میزبان E.coli shuffle تحت پروموتور T7 وارد شد. خالص­سازی پس از بیان با استفاده از ستون نیکل آگارز انجام شد و جهت بررسی فعالیت پروتئین تخلیص شده، آزمایش­های تکثیر سلولی، مهاجرت و اتصال به پروتئین ماتریکس خارج سلولی بررسی شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که نوع دیمر PDGF بیان و تخلیص شده در میزبان باکتریایی احتمالا بدلیل حفظ ساختار فولد شده صحیح، دارای هر دو فعالیت اصلی یعنی تکثیر سلولی بدلیل اتصال فعال به گیرنده سلولی و همچنین قابلیت اتصال به فیبرینوژن را حفظ کرده است.

چکیده پروتئین­های مورفوژنتیک استخوان (BMPs) یک زیرخانواده از ابر خانواده چند عملکردی فاکتور رشد تغییر دهنده بتا (TGF-β ) هستند؛از این رو از نظر بیوسنتز، ساختار، پیام رسانی و عملکرد زیستی شباهت بسیاری با سایر اعضای این ابرخانواده دارند. آن ها در فرآیندهای رشد و تمایز رویان تا نگهداری سلول های بالغ درگیر هستند. در میان اعضای این خانواده، BMP-2 پروتئینی با ارزش است که در فرآیندهای مختلف از جمله جوش خوردن ستون فقرات، ترمیم آسیب غضروف مفصلی، مهار تومور، درمان التهاب لثه و دندان نقش دارد. اهمیت بالای این پروتئین و پایین بودن میزان تولید آن در بدن موجب شده است که پژوهش­های متعددی در زمینه تولید BMP-2 نوترکیب در میزبان­های مختلف صورت گیرد. تولید این پروتئین به صورت نوترکیب در میزبان باکتریایی موجب کاهش هزینه­های تولید و در نتیجه استفاده متداول از BMP-2در درمان بیماری­های مختلف شده است. تاکنون تاثیرات مثبت پروتئین کامل BMP-2 و پپتیدهای مشتق از آن با هدف القای تشکیل استخوان در درمان شکستگی و بازسازی استخوان فک برای کاشت دندان قابل ملاحظه بوده است. با توجه به اهمیت بالینی زیاد BMP-2، نیاز به مطالعات بیشتر در رابطه با این پروتئین وجود دارد.

چکیده آلفا 1-آنتی‌تریپسین یک گلیکوپروتئین متشکل از 394 آمینواسید با وزن 52 کیلودالتون می‌باشد. این پروتئین به طور عمده توسط سلول‌های هپاتوسیت سنتز و به بافت‌های ریوی ترشح می‌شود و نقش اساسی در حفاظت بافت ریه در مقابل اثر نوتروفیل الاستاز دارد. از چالش‌های عمده در مواجهه با آلفا 1-آنتی‌تریپسین، ناپایداری ساختاری فرم تا خورده این پروتئین و در نتیجه تجمع آن به صورت پلیمرهای غیرفعال در بافت ریه می‌باشد. این امر فرد را مستعد ابتلا به بیماری‌های مزمن ریوی، آسم شدید و آمفیزم می‌نماید. یکی از درمان‌های رایج برای این اختلال، تزریق داخل وریدی آلفا 1-آنتی‌تریپسین می‌باشد. از طرفی، بیماران کاندید دریافت آلفا 1-آنتی‌تریپسین، دارای علائم اختلال تنفسی هستند و استفاده از بازکننده‌های برونش (سالبوتامول) خط اول درمان محسوب می‌شود. در این مطالعه تخلیص پروتئین توسط روش کروماتوگرافی تمایلی انجام و خلوص آن توسط روش ژل الکتروفورز تأیید شده است. اثر غلظت‌های مختلف سالبوتامول بر پلیمریزاسیون آلفا 1-آنتی‌تریپسین القاء شده توسط حرارت در دمای 60 درجه با روش‌های الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید غیر دناتوره کننده، پراکندگی دینامیکی نور و دو رنگ نمایی دورانی مورد سنجش قرار گرفته است. فعالیت پروتئین توسط روش تعیین ظرفیت مهاری تریپسین بررسی شده است. نتایج نشان می‌دهند که سالبوتامول با کاهش انعطاف‌پذیری حلقه مرکزی واکنش‌گر، سبب کاهش سرعت پلیمریزاسیون و در نتیجه کاهش سرعت از دست رفتن فعالیت در پروتئین آلفا 1-آنتی‌تریپسین می‌شود. بنابراین، این افزودنی می‌تواند گزینه مناسبی برای همراهی پروتئین آلفا 1-آنتی‌تریپسین و راهکاری مناسب برای درمان بیماری‌های وابسته به پلیمریزاسیون این پروتئین باشد.

چکیده مقدمه: امروزه ترمیم بافت استخوانی با افزایش اختلالات و آسیب‌های استخوانی از اهمیت خاصی برخوردار است. مهندسی بافت استخوان، راهکارهای ویژه‌ای را برای رفع این مشکلات فراهم کرده است. مطالعه حاضر با هدف تخلیص فیوژن پپتید نوترکیب حاوی تگ تمایلی به هیدروکسی‌آپاتیت با کمک ستون کروماتوگرافی سرامیکی انجام شد.
مواد و روش‌ها: در مطالعه حاضر، نوعی پپتید فیوژن طراحی شد که از یک‌سو حاوی توالی دمین اتصالی به هپارین بود که می‌تواند به انواع مختلفی از فاکتورهای رشد دخیل در ترمیم بافت متصل و باعث به‌دام‌انداختن این فاکتورها در محل ضایعه شود و از سوی دیگر حاوی یک تگ بود که شامل توالی به‌دست‌آمده از یک مطالعه آزمایشگاهی مبتنی بر بیان فاژی است. علت قراردادن این تگ، اتصال پپتید به داربست حاوی هیدروکسی‌آپاتیت و تخلیص پپتید نوترکیب توسط ستون هیدروکسی‌آپاتیت بود. بنابراین توالی ژن برای بیان در میزبان پروکاریوتی E. coli ﺳﻮﻳﻪ BL۲۱ بهینه‌سازی و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزیم‌های SacI و BamHI در وکتور بیانی pET-۲۱a(+) ساب‌کلون شد. بیان پپتید نوترکیب از طریق روش‌های SDS-PAGE و وسترن‌بلات بررسی شد. برای بهینه‌کردن شرایط تخلیص، با اعمال تغییرات اساسی در روش کار اصلی شرکت سازنده، تخلیص دو مرحله‌ای انجام شد. این پپتید با تمایل بالایی به ستون متصل و با خلوص قابل قبولی تخلیص شد. در نهایت وجود تجمعات پپتیدی از طریق روش DLS بررسی شد.
یافته‌ها: نتایج کلونی PCR، هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم‌های SacI و BamHI و تعیین توالی حاکی از صحت فرآیند کلونینگ بود. از طرفی بیان پپتید فیوژن توسط روش‌های SDS-PAGE و وسترن‌بلات تایید و مهاجرت آن روی ژل باعث ظاهرشدن باندی در حدود ۱۲کیلودالتون شد. تغییرات ایجادشده در روش کار شرکت سازنده باعث شد فرآیند تخلیص به‌صورت مطلوبی انجام شود و در نهایت نتایج روش DLS هم خلوص پپتید تخلیص شده را نشان داد.
نتیجه‌گیری: نتایج نشان‌دهنده بیان مطلوب و خلوص قابل توجه پپتید فیوژن طراحی‌شده در این مطالعه است.

چکیده پروتئین‌های مورفوژنتیک استخوانی (BMPs) متعلق به سوپرفامیلی فاکتور ترنسفورم‌کننده رشد بتا هستند. این مولکول‌ها در رشد و تکوین جنینی و همچنین تمایز سلول‌های مختلف نقش ایفا می‌کنند. در این خصوص دو مولکول همودایمر BMP-۲ و BMP-۷ نقش مهمی در تشکیل اکتوپیک استخوان دارند به‌طوری که دو نوع نوترکیب آن به‌صورت استفاده اکتوپیک در دسترس هستند. بعد از اتصال همودایمر BMP-۲ به گیرنده خود در سطح سلول، تجمع همودایمرهای نوع I و II گیرنده آن منجر به ایجاد پاسخ بیولوژیک در داخل سلول می‌شود. علی‌رغم وجود انواع نوترکیب BMP-۲ و BMP-۷ به‌دلیل خطرات ناشی از استفاده از آنها هنوز استراتژی استفاده از انواع آندوژن از طریق به دام‌انداختن با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال در محل ضایعه استخوانی در اولویت برنامه‌های تحقیقاتی است. روش جایگزین دیگر به‌جای استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال استفاده از گیرنده‌های طبیعی این لیگاند در بدن است. در این رابطه با توجه به K_d مناسب اتصال بخش اکتودمین گیرنده II مولکول BMP-۲ در این پروژه اقدام به بیان و تخلیص این قسمت با هدف به دام‌انداختن BMP-۲ اندوژن شد. قطعه پروتئینی اکتودمین گیرنده نوع II در میزبان باکتریایی بیان و تخلیص شد که با ارزیابی CD این پروتئین نوترکیب حاکی از ساختار مشابه با نوع طبیعی آن بود. همچنین ارزیابی اتصال آن به لیگاند BMP-۲ با الایزا مورد بررسی قرار گرفت و در ادامه K_d آن محاسبه شد. براساس نتایج به‌دست‌آمده، بخش اکتودمین گیرنده نوع دو می‌تواند با ویژگی اتصال مناسب در غلظت نانومولار به BMP-۲ متصل شود و در مطالعات بعدی می‌تواند به‌عنوان یک جایگزین به‌جای آنتی‌بادی مونوکلونال برای به دام‌اندازی مولکول‌های BMP آندوژن مورد استفاده قرار گیرد.

چکیده اندونوکلئاز CEL I، آنزیمی از خانواده S۱ اندونوکلئازها است. این آنزیم، با اختصاصیت بالا، توانایی شناسایی انواع جهش‌ها و جایگزینی بازها در مولکول DNA را دارد که این امر اهمیت آن را در قالب محصولات تجاری به‌منظور مصارف تحقیقاتی و آزمایشگاه‌های بالینی دوچندان می‌کند. اگرچه این آنزیم در گیاه کرفس یافت می‌شود اما به‌دلیل زمان‌بربودن فرآیند استخراج و همچنین بازدهی کم محصول نهایی، استخراج آن مقرون‌به‌صرفه نیست. علاوه بر این، با توجه به لزوم اعمال تغییرات پس از ترجمه برای دست‌یابی به ساختار فعال نهایی، تاکنون گزارشی مبنی بر بیان فرم فعال این آنزیم در میزبان‌های باکتریایی مشاهده نشده است. بنابراین یکی از منابع تولید فرم فعال این آنزیم، کلون و بیان آن در میزبان‌های یوکاریوتی از جمله مخمر و رده‌های سلولی پستانداران است. در این مطالعه، توالی ژن به‌منظور بیان در میزبان یوکاریوتی HEK۲۹۳T بهینه‌‎سازی و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزیم‌های KpnI و XhoI در وکتور بیانی pBudCE۴.۱ ساب‌کلون شد. سازه بیانی مورد نظر توسط لیپوفکتامین به رده سلولی HEK۲۹۳T ترانسفکت و بیان پروتئین نوترکیب از طریق روش‌های متعددی از جمله SDS-PAGE، الایزا، واکنش نسخه‌برداری معکوس و وسترن‌بلات تایید شد. آنالیز داده‌های SDS-PAGE و وسترن‌بلات وزن مولکولی در حدود ۳۰کیلو دالتون را تایید کرد. تخلیص با ستون حاوی رزین Ni-NTA انجام و مقدار پروتئین در حدود ۰/۲میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تعیین غلظت شد. درنهایت فعالیت اندونوکلئازی آنزیم، روی DNA هترودوپلکس حاصل از محصول PCR ژن جهش‌یافته و وحشی بررسی شد. نتایج نشان داد که بیان این پروتئین در میزبان HEK۲۹۳T فعالیت مناسبی دارد.