زیست فناوری

چکیده امروزه محققین بر استراتژی‌های جدید پایدارسازی و افزایش فعالیت آنزیم‌ها بمنظور استفاده گسترده‌تر آنها در صنایع مختلف متمرکزند. در این پژوهش از یک پلت فرم یکپارچه برای تثبیت و محافظت از پروتئین‌ها در محیط‌های صنعتی استفاده شده است. اگرچه لیپازها کاربردهای صنعتی گسترده‌ای دارند، استفاده از آنها در فرآیندهای صنعتی اغلب به دلیل پایداری کم در شرایط سخت محیطی با محدودیت مواجه می‌شود. در مطالعه حاضر جهت پایدارسازی آنزیم از یک استراتژی دومنظوره شامل تثبیت آنزیم و استفاده از لایه محافظ ارگانوسیلیکا استفاده شد. پس از بیان و تخلیص آنزیم لیپاز نوترکیب، تثبیت آن برروی نانوذره سیلیکا انجام و در مرحله بعد، از نانولایه ارگانوسیلیکا برای لایه‌گذاری پیرامون آنزیم استفاده شد. ضخامت لایه محافظ بهینه‌سازی و میزان تاثیر آن بر پایدارسازی آنزیم در مقابله با استرس‌‌های محیطی مطالعه شد. آنزیم‌ لایه‌گذاری ‌شده پایداری قابل‌توجهی نسبت به آنزیم‌ آزاد در برابر عوامل مختلف مانند نوسانات دمایی و عوامل شیمیایی نشان داد. علاوه بر این، نمونه‌های تثبیت شده فعالیت بهینه را در محدوده دمایی گسترده‌ای نشان دادند، که بر تطبیق‌پذیری و کارایی این رویکرد تأکید می‌کند. لایه ارگانوسیلیکا بطور چشمگیری بازده تاخوردگی مجدد پروتئین‌های دناتوره‌شده با SDS و اوره افزایش داد، که نشانگر کاربرد چندگانه این روش می‌باشد. یافته‌های این مطالعه نشان داد پلت‌فرم حاضر می‌تواند رویکردی امیدوارکننده برای افزایش کارایی و پایداری آنزیم‌های صنعتی در برابر چالش‌های متنوع محیطی باشد.

چکیده آنژیوژنز در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیک و پاتولوژیک از جمله رشد تومور دخالت دارد و VEGF مهم­ترین فاکتور در این فرایند محسوب می­شود. امروزه تولید آنتی­بادی های تک دمینی (VHH) با ویژگی مهار فاکتورهای رشد در تومورهای سرطانی یکی از راهکار­های جدید درمان سرطان می­باشد. در پژوهش قبلی ما مشخص شد VHHهای شتری تهیه شده با استفاده از نمایش فاژی علیه VEGF در مهار آن نقش اساسی ایفا می­کند. در این بین VHHی که دارای بیشترین تمایل به جایگاه اتصال به VEGF در بین دیگر اعضا کتاب­خانه فاژیVHH ها تهیه شده بود، انتخاب شد. با توجه به کارایی بیان سطحی E. coli با استفاده از موتیف لنگری پروتئین هسته‏زایی یخ (INP)، از این سیستم برای بیان پروتئین­ استفاده شد. از آنجا که در اتصال INP به سطح سلول فقط دمین انتهای آمینی نقش دارد، در طراحی سازه ژنی از 537 جفت باز ابتدایی ژن InaK استفاده شد. همچنین با قراردادن جایگاه برش آنزیم پروتئاز TEV بین INP وVEvhh10، امکان جداسازی موفقیت آمیز VEvhh10 از سطح سلول باکتری فراهم گردید. بیان سطحی با استفاده از پلاسمید pET-21a حاوی INP و VEvhh10علیه VEGF انجام شد. نتایج نشان داد دنباله INPگزینه مناسبی برای بیان سطحی VEvhh10در E. coli می­باشد. پس از تولیدVEvhh10 نوترکیب، جداسازی و تخلیص با استفاده از سانتریفیوژ و شستشوی متعدد انجام گرفته و اتصال آن به VEGF مورد بررسی قرار گرفت. اتصال موفقیت­آمیزVEvhh10 به VEGF نشان داد که پروتئین نوترکیب حاصل می­تواند برای کاربردهای درمانی و تشخیص بالینی بیماران در آینده مورد استفاده قرار گیرد.

چکیده به‌کارگیری آنزیم‌ها در حلال‌های آلی از لحاظ صنعتی و بیوتکنولوژیکی بسیار حائز اهمیت است. اما حلال‌های آلی با تاثیر بر ساختار پروتئین‌ها و واسرشتگی آنها باعث کاهش فعالیت و پایداری آنزیم‌ها می‌شوند. برای رفع این مشکل می‌توان از روش‌های پایدارسازی پروتئین‌ها نظیر مهندسی پروتئین، تغییرات شیمیایی و به‌کاربردن افزودنی‌ها استفاده نمود. در این مطالعه سیستئین‌پروتئازی از شیرابه گیاه فیکوس یوهانیس تخلیص شد و فعالیت و پایداری پروتئاز در حضور حلال‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. اثر ترهالوز، سوربیتول و ساکارز نیز بر فعالیت آنزیم در حضور حلال‌ها مطالعه شد. نتایج نشان داد حلال‌های آلی در غلظت‌های پایین باعث افزایش فعالیت آنزیم شده ولی با افزایش غلظت حلال‌ها فعالیت آنزیمی کاهش می‌یابد. اگرچه تا غلظت ۳۰% حلال‌ها، همچنان بیش از ۶۰% فعالیت آنزیم حفظ شده است. نتایج مطالعات پایداری پروتئاز نشان‌دهنده پایداری قابل توجه آنزیم نسبت به حلال‌های آلی است، به‌طوری که در حضور ۵۰% تمامی حلال‌ها، آنزیم همچنان ۹۰% پایداری‌ا‌ش را حفظ کرده است. بررسی اثر افزودنی‌ها نشان داد قندها موجب بهبود فعالیت آنزیم می‌شوند و بیشترین اثر حفظ فعالیت آنزیم مربوط به ترهالوز بود. با توجه به روش تخلیص آسان و فعالیت و پایداری قابل توجه پروتئاز مورد مطالعه در حضور حلال‌ها، این آنزیم برای استفاده در صنایع مختلف به‌خصوص سنتز پپتید پیشنهاد می‌شود.