زیست فناوری

چکیده آنژیوژنز[1] غیرطبیعی با بیماری­های مختلف نظیر سرطان و متاستاز آن، رتینوپاتی و آرتریت روماتوئید در ارتباط است. VEGF-A[2] مهمترین واسطه­ی آنژیوژنز در میان تمام فاکتورهای رشد است. فعالیت زیستی VEGF توسط دو گیرنده تیروزین کینازی VEGFR-1 و VEGFR-2 سلول­های اندوتلیال وساطت می­شود. سیگنالینگ VEGF از طریق VEGFR-2 مسیر اصلی آنژیوژنز است که منجر به تحریک رشد سریع سلول­های اندوتلیال به داخل تومور می­شود. این رسپتور از یک بخش خارج سلولی، یک بخش سیتوپلاسمی و یک دُمین ترانس ممبران تشکیل شده است. بخش خارج سلولی متشکل از هفت دُمین شبه ایمونوگلوبولین (D1-D7) است که دُمین های اول تا سوم به عنوان جایگاه اتصال لیگاند عمل می­کنند. در این مطالعه دُمین های خارج سلولی 3-1 گیرنده (KDR1-3) بصورت نوترکیب در Pichia pastoris بیان شد. یک قطعه DNA 975 نوکلوتیدی حاوی دُمین های 3-1 براساس توالی نوکلئوتیدی در GenBank و توالی پروتئین در Swiss-Prot طراحی شد. وکتور بیانی ترشحی نوترکیب (pPinkαHC/KDR1-3) ساخته شد و به روش الکتروپوریشن به داخل مخمر منتقل شد. سلول های نوترکیب با بیان بالا از طریق تکمیل اگزوتروفی آدنین شناسایی و کشت شدند. KDR1-3 تحت القا با متانول 1٪ بیان و با SDS-PAGE و تکنیک وسترن بلات تایید شد. پس از تخلیص با کروماتوگرافی تمایلی با رزین Ni-NTA، اتصال محصول بیان شده به hVEGF165 با الایزای مستقیم و الایزای مبتنی بر گیرنده اثبات شد. نتایج نشان داد که دُمین خارج سلولی 3-1 گیرنده VEGFR-2 انسانی با ساختار پروتئین یوکاریوتی، که هیچ گزارشی در مورد آن وجود ندارد، با موفقیت بیان شد. [1] Angiogenesis [2] Vascular endothelial growth factor-A