زیست فناوری

چکیده چکیده
پروتئین آلفا سینوکلئین اصلی‌ترین عامل شناخته شده در بیماری پارکینسون است. بیان این پروتئین‌ به دلیل خاصیت تجمعی که دارد با چالش همراه است. یکی از این چالش‌ها وجود پروتئین در رسوب باکتری است. مطالعات نشان داده که بیان پروتئین‌ها با برچسب‌هایی نظیر SUMO باعث افزایش بیان در فاز محلول می‌شود؛ ازاین‌رو بیان آلفاسینوکلیئن با این دنباله جهت افزایش پروتئین در فاز محلول بررسی شد. همچنین در این مطالعه سعی بر آن شد که تأثیر دنباله سومو بر فیبریلاسیون آلفاسینوکلئین بررسی شود. در این تحقیق ژن آلفا سینوکلئین با دنباله سومو ‌کلون شد. بیان پروتئین به فرم محلول صورت گرفت. پروتئین توسط ستون نیکل سفارز تخلیص شد و دیالیز انجام شد سپس بررسی فیبریلاسیون توسط نشر فلورسانس تیوفلاوین تی به مدت 72 ساعت انجام شد. مشاهده شد که پروتئین به همراه دنباله سومو میزان بیان بالاتری دارد و 95% از پروتئین در فاز محلول است از طرفی نشان داده شد که دنباله سومو خاصیت مهاری بر روند تشکیل فیبریل آمیلویید در مقایسه با آلفاسینوکلئین بدون دنباله سومو دارد. نتایج به‌دست‌آمده از مطالعات پیشین نشان می‌‌داد که اتصال دنباله سومو باعث افزایش بیان و میزان حلالیت پروتئین‌های نوترکیب می‌شود. این مطالعه نشان داد که حضور این دنباله به میزان بیان پروتئین و همچنین حضور پروتئین در فاز محلول کمک کرد. از طرفی مشاهدات آزمایشگاهی نشان داده که این دنباله خاصیت ضد فیبریلاسیونی برای پروتئین‌هایی با خاصیت آمیلوییدی دارد و در این مطالعه نشان داده شد که اضافه‌کردن دنباله سومو به پروتئین آلفاسینوکلئین مانع خاصیت تجمعی آن می‌شود.

چکیده چکیده
فرآیند ترمیم زخم، یک فرآیند پیچیده و پویا است که انواع سلول­ها و مسیرهای متابولیکی را مختلف را درگیر می­کند. این فرآیند از سه فاز التهابی، تکثیر سلولی و بازسازی بافتی تشکیل شده است. بهبود موفقیت آمیز زخم به تنظیم دقیق و هماهنگی بین عوامل درگیر بستگی دارد. تا سال­های اخیر استراتژی درمان­های زخم­های مزمن به آماده­سازی زخم، برداشتن بافت نکروزه شده، کنترل عفونت و التهاب محدود می­شد اما اخیرا استفاده از فاکتورهای رشد در جهت تسریع روند درمانی و بهبود زخم تایید شده­اند. از اولین انواع فاکتورهای رشد نوترکیب که در درمان زخم­های دیابتی به تایید رسیده است، فاکتور رشد نوترکیب انسانی PDGF-BB می‌باشد. مطالعات مختلف گزارش کرده است که PDGF به عنوان یک واسطه ی مهم در بهبود زخم در تسریع بهبودی، بهبود التهاب، تکثیر سلولی، رگزایی و بازسازی بافت کمک می­کند. در این مطالعه، توالی ژن PDGF-B انسانی، جهت کلون کردن در وکتور بیانی pET 21(a+) قرار گرفت و سپس برای بیان آن در میزبان E.coli shuffle تحت پروموتور T7 وارد شد. خالص­سازی پس از بیان با استفاده از ستون نیکل آگارز انجام شد و جهت بررسی فعالیت پروتئین تخلیص شده، آزمایش­های تکثیر سلولی، مهاجرت و اتصال به پروتئین ماتریکس خارج سلولی بررسی شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که نوع دیمر PDGF بیان و تخلیص شده در میزبان باکتریایی احتمالا بدلیل حفظ ساختار فولد شده صحیح، دارای هر دو فعالیت اصلی یعنی تکثیر سلولی بدلیل اتصال فعال به گیرنده سلولی و همچنین قابلیت اتصال به فیبرینوژن را حفظ کرده است.

چکیده نقاط بازرسی ایمنی، مولکول هایی هستند که سیستم ایمنی را تنظیم می‌کنند. برخی از سلول های تومور می توانند لیگاندهای متصل شونده به این نقاط بازرسی ایمنی را برای فرار از پاسخ های ایمنی ضد توموری بیان کنند. برخی از عوامل، مانند آنتی بادی ها، می توانند این نقاط بازرسی را مهار کنند. هدف از این مطالعه بیان یک دیا‌بادی دو منظوره جدید در فضای پری پلاسمیک باکتری E. coli BL21(DE3) برای مهار همزمان‌ دو نقطه بازرسی ایمنی، پروتئین مرتبط با ۴ (CTLA 4) و لیگاند متصل شونده (PD L1) است.
دیا‌بادی دو منظوره بر اساس ژن نواحی متغیر آنتی‌بادی‌های anti PD-L1 و anti CTLA 4 طراحی و جهت بیان درباکتری E. coli BL21(DE3) بهینه سازی و در پلاسمید بیانی pET21 کلون شد. پس از ترنسفرم کردن به داخل سویه بیانی E. coli BL21(DE3) اثر شرایط بیانی مختلف کشت مورد بررسی قرار گرفت، بیانDia-21 با وزن مولکولی ۵۵کیلو دالتون با الکتروفورز ژل SDS-PAGE و وسترن بلات تأیید شد. بهترین شرایط برای بیان پری پلاسمیک به فرم محلول بیان با 0/5 میلی مولار IPTG در دمای 23 درجه سانتی گراد محیط کشتLB و زمان ۱۸ ساعت به دست آمد. پروتئین بیان شده سپس با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز با بازده نهایی 0/4 میلی گرم در لیتر تخلیص و نهایت میل ترکیبی برهمکنش پروتئین خالص شده توسط Cell-ELISA بررسی شد.
پروتئین دیا‌بادی نوترکیب در یک سیستم باکتریایی بیان و خالص‌سازی و برهم‌کنش پروتئین دیا‌بادی نوترکیب باگیرنده سطح سلولی PDL-1 از طریق Cell-Elisa بررسی شد.

چکیده آنزیم کندروئیتیناز ABCI نوترکیب، یک لیاز باکتریایی است که گلیکوزآمینوگلیکان‌ها را تجزیه می‌کند و موجب رشد آکسون‌ها و بهبود عملکرد می‌شود.اما نگهداری این آنزیم به دلیل ناپایداری آن بسیار محدود شده است. یکی از راهبردهای غلبه بر این محدودیت تثبیت آنزیم می‌باشد. در این پژوهش، آنزیم کندروئیتیناز ABCI جداسازی شده از باکتری پروتئوس ولگاریس بر نانوذرات هیدروکسی‌آپاتیت، تثبیت شد. هیدروکسی‌آپاتیت یک زیست مواد سرامیکی فاقد سمیت بوده و دارای مساحت سطح بالایی می‌باشد، که برای بارگذاری مقدار زیادی از آنزیم سودمند است. بنابراین برای افزایش پایداری آنزیم کندروئیتیناز ABCI، تثبیت بر روی نانوذرات هیدروکسی آپاتیت به مدت 4 ساعت از طریق جذب فیزیکی در بافر فسفات در سه pH ۵، 6/8 و ۸ در دمای 4 درجه سانتی گراد انجام شد. در ادامه تثبیت آنزیم بر روی نانوذرات هیدروکسی آپاتیت از طریق تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی روبشی- نشر میدانی و طیف‌سنجی فرابنفش، قبل و بعد از تثبیت مورد تایید قرار گرفت. سپس جهت بدست آوردن pH و دمای بهینه، میزان فعالیت نانوسیستم (نانوهیدروکسی آپانیت حاوی آنزیم) درسه pH و دما (^◦C۴، ^◦C۲۵و^◦C۳۷) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج فعالیت بالاتری را در pH ۵ و دمای ^◦C 4 نسبت به سایر pH و دماها برای نانوسیستم نشان داد. بر اساس نتایج بدست آمده که نشان دهنده پایداری سامانه حاوی آنزیم در هر سه دما نسبت به آنزیم آزاد می باشد، این نانوسیستم می تواند یک گزینه مناسب برای کاربردهای بالینی در آینده باشد.

چکیده ژنوم یوکاریوتی حاوی چندین محل شروع همانندسازی می‌باشد. بررسی‌ها نشان می‌دهد که روند و ترتیب فعال شدن این منشأها با نظم خاصی صورت می‌گیرد که این فرآیند منظم را اصطلاحاَ زمانبندی همانندسازی (Replication timing) می-گویند. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که فاکتورهای زیادی در تنظیم زمانبندی فرآیند همانندسازی نقش دارند. یکی از مهمترین این فاکتورها پروتئین متصل‌شونده به Rap1 (Rif1)، می‌باشد که نقش اساسی را در تنظیم برنامه زمانبندی همانندسازی در مخمر و یوکاریوت‌های پیشرفته‌تر ایفا می‌کند. قسمت عمده ساختار این پروتئین به صورت نامنظم بوده و این ویژگی‌ها مانع از بیان Rif1 به صورت پایدار شده و مطالعه بر روی آن را دشوار می‌کند.
هدف از مطالعه کنونی بیان نوترکیب دمین C-ترمینال پروتئین Rif1 موشی (muRif1-CTD) به صورت محلول می‌باشد. بدین منظور ژن muRif1-CTD از سازه یوکاریوتی حاوی ژن کامل Rif1 به کمک PCR استخراج و در وکتور بیانی pPAL7 که حاوی برچسب Profinity eXact بود، قرار گرفت. محلول‌سازی پروتئین با استفاده از دترجنت‌های مختلف و در مرحله بعد حذف دترجنت با استفاده از دیالیز صورت پذیرفت. به منظور اطمینان از اینکه پروتئین محلول شده دارای فعالیت است آنالیز برهمکنش پروتئین Rif1 با ساختار G4 (که قبلا در رابطه با اتصال به Rif1 معرفی شده بود) با روش ژل شیفت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی نشان داد که استفاده از دترجنت می‌تواند برای محلول سازی پروتئین Rif1 بدون اثرگذاری بر مراحل خالص‌سازی آن مورد استفاده قرار گیرد. لیکن در مورد این پروتئین در صورت فقدان کامل دترجنت، این پروتئین به صورت محلول نخواهد بود.

چکیده رسوب پروتئینها در اثر فرآیند تجمعدر درون یا بیرون سلول ها باعث ایجاد بسیاری از بیماری هایعصبی نظیر آلزایمر، تشنج هانتینگتون یا پارکینسون میشود. بیماری پارکینسون پس از آلزایمر دومین بیماری شایععصبی است که طی آن در اثر تجمع اجسام لوی و تخریب نورون های دوپامین اختلالات حرکتی در بیماران به وجود می آید. پروتئین آلفا سینوکلئین حاوی ۱۴۰ اسید آمینه، اصلی ترین پروتئین شناخته شده در تجمعات اجسام لوی است. طی فرآیند تجمع، مونومرهای پروتئینی آلفا سینوکلئینبصورت الیگومر به هم متصل شده و در نهایت بصورت رشته های آمیلوئیدی در می آیند. تاکنون دارویی برای توقف یا به تاخیر انداختن پیشرفت پارکینسون وجود نداشته اما مطالعات بر مکانیسم مولکولی تشکیل آمیلوئیدها و شناسایی مهار کننده های آن در حال افزایش است. بدین منظور در این تحقیق تاثیر دمین BRICHOSحاصل از BRI2 که می تواند وظایف مختلفی از جمله خاصیت ضد تجمعی داشته باشد بر فرایند تجمع آلفا سینوکلئینبه عنوان پروتئین مدل بررسی گردید. ژن مورد نظر ابتدا بهینه و سنتز گردید و سپس توسط PCRتکثیر گردید. محصول توسط آنزیم های Xho I و Nde1هضم آنزیمی شده و وارد وکتور بیانیpET28a گردید که به باکتری E.Coliترانسفورم شد. در آخر پپتید مورد نظر با کروماتوگرافی نیکل سفارز تخلیص شد. ژن آلفا سینوکلئین نیزبه صورت مجزا بیان و تخلیص گردید. اثر ضد تجمعی دمینBRICHOSبر فیبریلاسیون آلفا سینوکلئین با استفاده از روش فلورسانس تیوفلاوین Tو تکنیک TEMبررسیشد.

چکیده فیبرینوژن یکی از اجزای اصلی آبشار انعقادی است و به دنبال آسیب بافت، به سرعت، داربست نامحلول فیبرینی را تشکیل می دهد. فیبرین یک زیست پلیمر رشته‌ای است که به طور طبیعی در هنگام لخته شدن خون از پلیمریزاسیون فیبرینوژن تشکیل می شود. پس از آسیب‌های بافتی و شروع آبشار انعقادی، پلیمریزاسیون فیبرینوژن محلول توسط آنزیم ترومبین در یک شبکه فیبرین نامحلول آغاز و با همراهی پلاکت ها، لخته خون را تشکیل می دهند. این شبکه فیبرین برای ایجاد هموستاز پس از آسیب بافتی بسیار حایز اهمیت است. این زیست‌ پلیمر بدن همچنین به عنوان یک داربست موقت در ترمیم زخم نقش اصلی را ایفا می کندوبه دلیل ویژگی ساختاری و عملکرد فیزیولوژیک منحصربفرد خود، در پزشکی بازساختی مورد استفاده قرار میگیرد. فیبرین قادر به انتقال پروتئین های ماتریس خارج سلولی (ECM)مانند فیبرونکتین و فاکتورهای رشد است. از انواع داربست های اصلی فیبرینی مانند فیبرین غنی از پلاکت (PRF)و پلاسمای غنی از پلاکت (PRP)به عنوان زیست مواد اتولوگ در پزشکی بازساختی، ترمیم زخم، ارتوپدی و درمان‌های بازسازی و زیبایی پوست مورد استفاده قرار می‌گیرند. مشتقات و محصولات تخریب فیبرین نیز با تحریک نفوذ سلول ها و بازسازی بافت، نقش مهمی در روند ترمیم زخم ایفا می کنند و آنها به طور گسترده به عنوان ماده بیولوژیکی در توسعه محصولات جدید برای بیش از یک قرن مورد استفاده قرار گرفته اند.