زیست فناوری

چکیده SH-SY5Y رده سلولی نوروبلاستوما است که به عنوان مدلی از سرطان و اختلالات نورودژنراتیو در مطالعات عصبی-تجربی استفاده می شود. یکی از عوامل ایجاد بیماری نقص در مسیر آپوپتوز می‌باشد. اختلال در پروتئین­های آپوپتوزی بر فرایند درمان­ و پاسخ به دارو تاثیر دارد. در سلول­های عصبی به دلیل بیان بالای پروتئین‌های مهارکننده‌ آپوپتوز، اثرپذیری داروها چندان نیست. درمان ترکیبی یکی از روش‌های درمان در حال توسعه است. هدف از این پژوهش، ارزیابی اثرپذیری داروی دوکسوروبیسین بر آپوپتوز در سلول SH-SY5Y در شرایط بیان بالای کاسپاز9 است. کاسپاز9 آنزیم کلیدی و پیش برنده آپوپتوز داخلی است. ابتدا با MTT سطح زنده­مانی سلول تحت تاثیر غلظت­های مختلف دارو بدست آمد. سپس در سلول ژن کاسپاز9 ترانسفکت شد و تحت تاثیر غلظت کمتر از IC50 دارو قرار گرفت و با روش­های مختلف، سطح انرژی و مرگ سلول بررسی شد. نتایج حاصل از سنجش ATP نشان داد با افزایش بیان کاسپاز9 در حضور دارو، سطح ATP کاهش می­یابد. فعالیت کاسپاز3/7 که شاخصی از مرگ سلول است بیانگر افزایش مرگ طی اثر دارو بر سلول دریافت کننده کاسپاز است. نشر حاصل از رنگ‌آمیزی پروپیدیوم به هوخست نشان داد بیان کاسپاز9 در ترکیب با دارو موجب القای بیشتر مرگ خواهد شد برای اطمینان از سطوح بیانی پروتئین القاکننده مرگ سلولی، با وسترن بلات مقدار پروتئین کاسپاز3 بررسی شد که افزایش معناداری در حالت ترکیب کاسپاز9 و دارو نشان داد. یافته‌های این پژوهش نشان داد القای بیان کاسپاز9 تاثیر دارو را تشدید می کند و درمان ترکیبی ممکن است بر پاسخ پذیری بیماری های نورونی موثر باشد.

چکیده اهداف: مرگ سلولی برنامه ریزی شده فرایند مهمی است که طی تکامل بدون تغییر باقی مانده است. این فرایند در تنظیم شرایط فیزیولوژیکی و پاتوفیزیولوژیکی موثر است. آپوپتوز شناخته شده_­ترین نوع مرگ سلولی است که در بسیاری از تومورها مختل شده و سبب مقاومت به درمان می شود. کاسپاز9 یکی از پروتئین­های کلیدی مسیر میتوکندریایی آپوپتوز است. فعال شدن کاسپاز9 منجر به فعال شدن کاسپاز­های اجرایی مانند کاسپاز3/۷ شده و با راه اندازی آبشار کاسپازی منجر به مرگ سلول می­­شود. در این مطالعه، ژن کاسپاز9 در وکتور یوکاریوتی pcDNA3.1(+) کلون و عملکرد آن در سلول­ بررسی شد.
مواد و روش­ها: ژن کاسپاز9 طی PCR با پرایمر­های اختصاصی تکثیر و پس از هضم دوگانه با آنزیم­های KpnI و BamHI به پلاسمید pcDNA برش خورده الحاق شد. پلاسمید نوترکیب حاصل پس از تعیین توالی به رده سلولی SH-SY5Y ترنسفکت و با داروی دوکسوروبیسین تیمار شد. عملکرد آن بر مرگ سلولی با روش رنگ آمیزی تریپان بلو و PI، و سنجش فعالیت کاسپاز۳ بررسی و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد.
یافته ها: کلونینگ ژن کاسپاز9 انجام و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد. افزایش بیان کاسپاز۹ در سلول منجر به پردازش خود بخودی آن طی همودایمریزاسیون و در نتیجه القای مرگ سلولی شده و حساسیت سلول نسبت به دوکسوروبیسین را افزایش و زنده مانی سلولی را کاهش داد.
نتیجه گیری: ژن کاسپاز9 کلون شده در سلول فعالیت نشان داد و آپوپتوز را در حضور دوکسوروبیسین از طریق خود فعال­سازی و متعاقبا تشدید فعال­سازی کاسپاز۳ افزایش داد.