زیست فناوری

چکیده چکیده
پروتئین آلفا سینوکلئین اصلی‌ترین عامل شناخته شده در بیماری پارکینسون است. بیان این پروتئین‌ به دلیل خاصیت تجمعی که دارد با چالش همراه است. یکی از این چالش‌ها وجود پروتئین در رسوب باکتری است. مطالعات نشان داده که بیان پروتئین‌ها با برچسب‌هایی نظیر SUMO باعث افزایش بیان در فاز محلول می‌شود؛ ازاین‌رو بیان آلفاسینوکلیئن با این دنباله جهت افزایش پروتئین در فاز محلول بررسی شد. همچنین در این مطالعه سعی بر آن شد که تأثیر دنباله سومو بر فیبریلاسیون آلفاسینوکلئین بررسی شود. در این تحقیق ژن آلفا سینوکلئین با دنباله سومو ‌کلون شد. بیان پروتئین به فرم محلول صورت گرفت. پروتئین توسط ستون نیکل سفارز تخلیص شد و دیالیز انجام شد سپس بررسی فیبریلاسیون توسط نشر فلورسانس تیوفلاوین تی به مدت 72 ساعت انجام شد. مشاهده شد که پروتئین به همراه دنباله سومو میزان بیان بالاتری دارد و 95% از پروتئین در فاز محلول است از طرفی نشان داده شد که دنباله سومو خاصیت مهاری بر روند تشکیل فیبریل آمیلویید در مقایسه با آلفاسینوکلئین بدون دنباله سومو دارد. نتایج به‌دست‌آمده از مطالعات پیشین نشان می‌‌داد که اتصال دنباله سومو باعث افزایش بیان و میزان حلالیت پروتئین‌های نوترکیب می‌شود. این مطالعه نشان داد که حضور این دنباله به میزان بیان پروتئین و همچنین حضور پروتئین در فاز محلول کمک کرد. از طرفی مشاهدات آزمایشگاهی نشان داده که این دنباله خاصیت ضد فیبریلاسیونی برای پروتئین‌هایی با خاصیت آمیلوییدی دارد و در این مطالعه نشان داده شد که اضافه‌کردن دنباله سومو به پروتئین آلفاسینوکلئین مانع خاصیت تجمعی آن می‌شود.

چکیده نقاط بازرسی ایمنی، مولکول هایی هستند که سیستم ایمنی را تنظیم می‌کنند. برخی از سلول های تومور می توانند لیگاندهای متصل شونده به این نقاط بازرسی ایمنی را برای فرار از پاسخ های ایمنی ضد توموری بیان کنند. برخی از عوامل، مانند آنتی بادی ها، می توانند این نقاط بازرسی را مهار کنند. هدف از این مطالعه بیان یک دیا‌بادی دو منظوره جدید در فضای پری پلاسمیک باکتری E. coli BL21(DE3) برای مهار همزمان‌ دو نقطه بازرسی ایمنی، پروتئین مرتبط با ۴ (CTLA 4) و لیگاند متصل شونده (PD L1) است.
دیا‌بادی دو منظوره بر اساس ژن نواحی متغیر آنتی‌بادی‌های anti PD-L1 و anti CTLA 4 طراحی و جهت بیان درباکتری E. coli BL21(DE3) بهینه سازی و در پلاسمید بیانی pET21 کلون شد. پس از ترنسفرم کردن به داخل سویه بیانی E. coli BL21(DE3) اثر شرایط بیانی مختلف کشت مورد بررسی قرار گرفت، بیانDia-21 با وزن مولکولی ۵۵کیلو دالتون با الکتروفورز ژل SDS-PAGE و وسترن بلات تأیید شد. بهترین شرایط برای بیان پری پلاسمیک به فرم محلول بیان با 0/5 میلی مولار IPTG در دمای 23 درجه سانتی گراد محیط کشتLB و زمان ۱۸ ساعت به دست آمد. پروتئین بیان شده سپس با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی نیکل آگارز با بازده نهایی 0/4 میلی گرم در لیتر تخلیص و نهایت میل ترکیبی برهمکنش پروتئین خالص شده توسط Cell-ELISA بررسی شد.
پروتئین دیا‌بادی نوترکیب در یک سیستم باکتریایی بیان و خالص‌سازی و برهم‌کنش پروتئین دیا‌بادی نوترکیب باگیرنده سطح سلولی PDL-1 از طریق Cell-Elisa بررسی شد.

چکیده ژنوم یوکاریوتی حاوی چندین محل شروع همانندسازی می‌باشد. بررسی‌ها نشان می‌دهد که روند و ترتیب فعال شدن این منشأها با نظم خاصی صورت می‌گیرد که این فرآیند منظم را اصطلاحاَ زمانبندی همانندسازی (Replication timing) می-گویند. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که فاکتورهای زیادی در تنظیم زمانبندی فرآیند همانندسازی نقش دارند. یکی از مهمترین این فاکتورها پروتئین متصل‌شونده به Rap1 (Rif1)، می‌باشد که نقش اساسی را در تنظیم برنامه زمانبندی همانندسازی در مخمر و یوکاریوت‌های پیشرفته‌تر ایفا می‌کند. قسمت عمده ساختار این پروتئین به صورت نامنظم بوده و این ویژگی‌ها مانع از بیان Rif1 به صورت پایدار شده و مطالعه بر روی آن را دشوار می‌کند.
هدف از مطالعه کنونی بیان نوترکیب دمین C-ترمینال پروتئین Rif1 موشی (muRif1-CTD) به صورت محلول می‌باشد. بدین منظور ژن muRif1-CTD از سازه یوکاریوتی حاوی ژن کامل Rif1 به کمک PCR استخراج و در وکتور بیانی pPAL7 که حاوی برچسب Profinity eXact بود، قرار گرفت. محلول‌سازی پروتئین با استفاده از دترجنت‌های مختلف و در مرحله بعد حذف دترجنت با استفاده از دیالیز صورت پذیرفت. به منظور اطمینان از اینکه پروتئین محلول شده دارای فعالیت است آنالیز برهمکنش پروتئین Rif1 با ساختار G4 (که قبلا در رابطه با اتصال به Rif1 معرفی شده بود) با روش ژل شیفت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی نشان داد که استفاده از دترجنت می‌تواند برای محلول سازی پروتئین Rif1 بدون اثرگذاری بر مراحل خالص‌سازی آن مورد استفاده قرار گیرد. لیکن در مورد این پروتئین در صورت فقدان کامل دترجنت، این پروتئین به صورت محلول نخواهد بود.

چکیده رسوب پروتئینها در اثر فرآیند تجمعدر درون یا بیرون سلول ها باعث ایجاد بسیاری از بیماری هایعصبی نظیر آلزایمر، تشنج هانتینگتون یا پارکینسون میشود. بیماری پارکینسون پس از آلزایمر دومین بیماری شایععصبی است که طی آن در اثر تجمع اجسام لوی و تخریب نورون های دوپامین اختلالات حرکتی در بیماران به وجود می آید. پروتئین آلفا سینوکلئین حاوی ۱۴۰ اسید آمینه، اصلی ترین پروتئین شناخته شده در تجمعات اجسام لوی است. طی فرآیند تجمع، مونومرهای پروتئینی آلفا سینوکلئینبصورت الیگومر به هم متصل شده و در نهایت بصورت رشته های آمیلوئیدی در می آیند. تاکنون دارویی برای توقف یا به تاخیر انداختن پیشرفت پارکینسون وجود نداشته اما مطالعات بر مکانیسم مولکولی تشکیل آمیلوئیدها و شناسایی مهار کننده های آن در حال افزایش است. بدین منظور در این تحقیق تاثیر دمین BRICHOSحاصل از BRI2 که می تواند وظایف مختلفی از جمله خاصیت ضد تجمعی داشته باشد بر فرایند تجمع آلفا سینوکلئینبه عنوان پروتئین مدل بررسی گردید. ژن مورد نظر ابتدا بهینه و سنتز گردید و سپس توسط PCRتکثیر گردید. محصول توسط آنزیم های Xho I و Nde1هضم آنزیمی شده و وارد وکتور بیانیpET28a گردید که به باکتری E.Coliترانسفورم شد. در آخر پپتید مورد نظر با کروماتوگرافی نیکل سفارز تخلیص شد. ژن آلفا سینوکلئین نیزبه صورت مجزا بیان و تخلیص گردید. اثر ضد تجمعی دمینBRICHOSبر فیبریلاسیون آلفا سینوکلئین با استفاده از روش فلورسانس تیوفلاوین Tو تکنیک TEMبررسیشد.

چکیده خصوصیات منحصربه‌فرد و وابسته به اندازه نانوذرات کوانتومی از جمله گستره وسیع طیف‌های جذبی، طیف نشری تیز و باریک و متناسب با اندازه نانوذره، بهره کوانتومی زیاد و ضریب جذب مولی بسیار زیاد منجر به این شده است که امروزه نانوبلورهای نیمه‌هادی نقاط کوانتومی به‌عنوان برچسب‌های فلورسانسی مناسبی در حوزه‌های مختلف فیزیک، شیمی و زیست‌شناسی استفاده گسترده‌ای پیدا کنند. در این مطالعه در ابتدا نانوذرات کوانتومی CdSe/ZnS پوشیده‌شده با لیگاند سطحی اولئیل‌آمین با روش سنتز تزریق در دمای بالا تحت شرایط خلا و جریان نیتروژن پایدار در دمای °C۳۲۰ سنتز شد. در ادامه به‌منظور بررسی اثر خاموش‌سازی رنگ‌های گروه آزو که از پرکابردترین و سرطان‌زاترین رنگ‌های شیمیایی مورد استفاده در صنایع مختلف هستند روی نشر این نانوذرات، به‌منظور سازش‌پذیری نانوذرات با محیط‌های آبی از تکنیک جایگزینی لیگاند سطحی مرکاپتوپروپیونیک‌اسید به‌عنوان یک لیگاند هیدروفیل مناسب در سطح نانوذرات استفاده شد. پس از تایید سنتز درست نانوذرات CdSe/ZnS توسط میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) و استفاده از پیک‌های نمونه استاندارد مربوط به هسته و پوسته نانوذرات سنتزشده در طیف‌سنجی پراش پرتوی ایکس (XRD)، نتایج حاصل از مطالعات نشان داد که رنگ مونوآزوی متیل‌رد به‌دلیل هم‌پوشانی طیف جذبی‌ که با طیف نشری این نانوذرات دارد با کارآیی بسیار خوبی منجر به خاموش‌سازی نشر این نانوذرات می‌شود.