زیست فناوری

چکیده اکتیوین A یکی از اعضای خانواده‌ی فاکتور رشد تغییردهنده‌ی بتا (TGF-β) است که نقش مهمی در فرآیندهای فیزیولوژیکی متعدد همانند تمایز سلولی، ترمیم بافتی، رگ زایی، تمایز سلول های بنیادی، چسبندگی سلولی و آپوپتوز دارد. لذا با توجه به کاربردهای بالینی متعدد این پروتئین، تولید نوترکیب آن سودمند می‌باشد.از آنجاییکه اشرشیاکلی یکی از محبوب ترین میزبان ها برای تولید پروتئین‌های نوترکیب است، در این تحقیق از بیان سیتوپلاسمی در این سویه به منظور تولید مقادیر بالایی از اکتیوین A استفاده گردید. بدین منظورابتدا cDNA ناحیه‌ی بالغ ژن اکتیوین A تکثیر و در وکتور (+)pET28a کلون گردید. وکتور حاصل به سویه‎های (DE3)BL21، plysS(DE3)BL21 و Rosetta gami (DE3)BL21 انتقال داده شد. پس از القای پروموتر با استفاده از IPTG و بیان پروتئین، تولید اکتیوین A به وسیله‌ی روش های SDS-PAGE و وسترن بلات تایید شد. نتایج نشان داد که بیان اکتیوین A در سیتوپلاسم هر سه سویه یک رویکرد موثر برای دست‌یابی به میزان بالایی از پروتئین نوترکیب است اما در این بین، سویه (DE3)BL21 مقدار بیشتری پروتئین تولید کرده است. در مرحله ی بعد به منظور دست یابی به شکل محلول اکتیوین A از بیان همزمان چپرون‌های سیتوپلاسمی TF، GroEL/ES و DnaK/J با وکتور (+)pET28a که حامل اکتیوینA بود استفاده شد. نتایج SDS-PAGE و وسترن بلات نشان داد که بیان همزمان اکتیوین A با استفاده از پلاسمید چپرونی pGro7 که دارای چپرون های GroEL و GroES می‌باشد، در سویه‌ی(DE3)BL21 یک رویکرد مؤثر برای تولید پروتئین اکتیوین A محلول است.

چکیده ، یک باکتری گرم منفی E.Coli

چکیده اهداف: روش‌های تخریب سلولی مختلفی برای استخراج پروتئین‌های داخل سیتوپلاسمی وجود دارد. هدف مطالعه حاضر انتخاب بهترین روش استخراج پروتئین امتزاجی نوترکیب تری‌پاراتید از میزبان باکتریایی اشریشیا کلی و دستیابی به بهترین شرایط تخلیص آن بود.
مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربی حاضر، سلول‌های باکتری با روش‌های سونیکاسیون با دورهای متفاوت، له‌کردن در نیتروژن مایع، هموژناسیون تحت دو فشار مختلف و روش شیمیایی شکسته شدند. نمونه‌های مربوط به رسوب و محلول رویی حاصل از هر روش، در ژل سدیم‌دودسیل‌سولفات الکتروفورز شدند. سلول‌های شکسته‌شده در محیط کشت لوریا برتانی جامد کشت و به‌روش گرم رنگ‌آمیزی شدند. کروماتوگرافی تمایلی نیکل برای خالص‌سازی پروتئین در شرایط واسرشته و غیرواسرشته به‌ترتیب با شیب pH و غلظت ایمیدازول به کار رفت. تمامی نمونه‌ها روی ژل سدیم‌دودسیل‌سولفات- پلی‌اکریل‌آمید برده شدند و محاسبه میزان پروتئین تخلیص‌شده با آزمون میکروبرادفورد صورت گرفت.
یافته‌ها: در دورهای ۲۰ و ۲۵دور در دقیقه بخش زیادی از پروتئین امتزاجی وارد بخش محلول شد. در روش له‌کردن در نیتروژن مایع، پروتئین‌ها بیشتر وارد بخش رسوب شدند. تخریب سلول‌ها در روش شیمیایی کامل بود. شکستن سلول‌ها با هموژناسیون تحت فشار ۵۰بار، بیشتر از ۱۵بار بود. در تخریب شیمیایی همراه با سونیکاسیون مقدار بسیار زیادی از پروتئین امتزاجی وارد بخش محلول شد. در شرایط غیرواسرشته هیچ پروتئین امتزاجی نوترکیبی با بافر جداسازی از ستون خارج نشد، اما در شرایط واسرشته مقدار زیادی از پروتئین تخلیص شد.
نتیجه‌گیری: در تخریب شیمیایی همراه با سونیکاسیون، ۷/۹۷% پروتئین کل به بخش محلول وارد می‌شود و تخلیص در شرایط واسرشته برخلاف شرایط غیرواسرشته به‌طور مناسب و مطلوب صورت می‌گیرد.

چکیده اهداف: فاکتور رشد عصبی β–NGF یک عامل درمانی مهم در درمان بسیاری از بیماری‌های تحلیل عصبی مثل آلزایمر است، لذا تولید نوترکیب آن در مقیاس انبوه از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. هدف از بررسی حاضر بهینه‌سازی فاکتورهای موثر در دست‌یابی به بیشترین میزان تولید پروتئین β–NGF در فرمانتور است.
مواد و روش‌ها: از آنجا که باکتری E. coli سویه بیانی مناسبی برای تولید در مقیاس صنعتی است، در مطالعه حاضر از سویه DE_۳ باکتری E. coli به‌منظور تولید پروتئین نوترکیب β–NGF استفاده شد. همچنین از بیوراکتور ۵لیتری به‌منظور تولید پروتئین استفاده شد و میزان اکسیژن محلول (DO%) و دمای پس از القا با استفاده از روش نرم‌افزار آماری سطح پاسخ (RSM) بهینه‌سازی شد. ابتدا تاثیر این دو متغیر بر میزان تولید پروتئین مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور در هر آزمایش کل محتوای پروتئینی استخراج و با روش برادفورد تعیین غلظت شد.
یافته‌ها: نتایج نشان داد که بهینه شرایط برای دست‌یابی به بیشترین میزان تولید پروتئین دمای پس از القای ºC۵/۲۸ و DO، ۳۰% است و در این شرایط غلظت پروتئین تولیدی ۶۱/۰±۶/۹میکروگرم بر میلی‌لیتر است. نهایتاً تاثیر این فاکتورها بر تولید پروتئین β–NGF با استفاده از روش دات‌بلات مورد ارزیابی قرار گرفت که نتایج نشان‌دهنده بیشترین میزان تولید در شرایط بهینه‌سازی‌شده است.
نتیجه‌گیری: به‌طور کلی می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که میزان DO% و دمای پس از القا علاوه بر تاثیر بر رشد باکتری نوترکیب E. coli در بیوراکتور، بر میزان تولید و بیان پروتئین های نوترکیب (مثل β–NGF) نیز تاثیر مستقیمی دارد.