چکیده ال-گلوتامیناز یکی از اعضای خانواده آمیدوهیدرولاز هاست که به ابر خانواده بتا-لاکتاماز های وابسته به سرین و پروتئین های متصل به پنی سیلین تعلق دارد. در دهه اخیر ال-گلوتامیناز به خاطر توانایی کاتالیتیکی خود مورد توجه قرار گرفته است و در میان صنایع مختلف به ویژه پزشکی و درمانی ارزش بالایی یافته است. تحقیقات در مورد ال-گلوتامیناز در طول چهار دهه پیشرفت هایی داشته است اما در مقایسه با سایر آنزیم های مهم صنعتی این پیشرفت سرعت کمی داشته است. هزینه نسبتا بالای تولید ال-گلوتامیناز یکی از موانع بزرگی است که کاربرد های صنعتی آن را به تاخیر می اندازد. از طرفی منابع کافی برای تولید انبوه آنزیم به منظور بررسی آزمایشات کلینیکی گسترده موجود نمی باشد. هدف از این مطالعه بیان نوترکیب ال-گلوتامیناز به صورت محلول از سویه  Alteribacillus bidgolensis(P4BT) در سیستم بیانیBL21(DE3)  Escherichia coli و همچنین بررسی فعالیت آنزیم می باشد. در این پژوهش ژن ال-گلوتامیناز با استفاده از وکتور بیانی pET30a  با موفقیت در سیستم بیانی BL21(DE3)  E.coli کلون شد. بیان محلول در شرایط کشت دمای 28 درجه سانتی گراد و با کمک وکتور تجاری pG-KJE8 که حاوی مجموعه ای از چاپرون های مولکولی است انجام شد. در نهایت، سنجش فعالیت ویژه آنزیم خالص و دیالیز شده در دمای 40 درجه سانتی گراد و pH 8 انجام شد و فعالیت آنزیمی برای غلظت 8 میلی مولار سوبسترا U/ mg   01/0 ± 53/0 بدست آمد.  Km ال-گلوتامیناز mM 10/3 و Vmax آن  U/ mg 62/0 محاسبه شد.




 

چکیده چکیده
فرآیند ترمیم زخم، یک فرآیند پیچیده و پویا است که انواع سلول­ها و مسیرهای متابولیکی را مختلف را درگیر می­کند. این فرآیند از سه فاز التهابی، تکثیر سلولی و بازسازی بافتی تشکیل شده است. بهبود موفقیت آمیز زخم به تنظیم دقیق و هماهنگی بین عوامل درگیر بستگی دارد. تا سال­های اخیر استراتژی درمان­های زخم­های مزمن به آماده­سازی زخم، برداشتن بافت نکروزه شده، کنترل عفونت و التهاب محدود می­شد اما اخیرا استفاده از فاکتورهای رشد در جهت تسریع روند درمانی و بهبود زخم تایید شده­اند. از اولین انواع فاکتورهای رشد نوترکیب که در درمان زخم­های دیابتی به تایید رسیده است، فاکتور رشد نوترکیب انسانی PDGF-BB می‌باشد. مطالعات مختلف گزارش کرده است که PDGF به عنوان یک واسطه ی مهم در بهبود زخم در تسریع بهبودی، بهبود التهاب، تکثیر سلولی، رگزایی و بازسازی بافت کمک می­کند. در این مطالعه، توالی ژن PDGF-B انسانی، جهت کلون کردن در وکتور بیانی pET 21(a+) قرار گرفت و سپس برای بیان آن در میزبان E.coli shuffle تحت پروموتور T7 وارد شد. خالص­سازی پس از بیان با استفاده از ستون نیکل آگارز انجام شد و جهت بررسی فعالیت پروتئین تخلیص شده، آزمایش­های تکثیر سلولی، مهاجرت و اتصال به پروتئین ماتریکس خارج سلولی بررسی شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که نوع دیمر PDGF بیان و تخلیص شده در میزبان باکتریایی احتمالا بدلیل حفظ ساختار فولد شده صحیح، دارای هر دو فعالیت اصلی یعنی تکثیر سلولی بدلیل اتصال فعال به گیرنده سلولی و همچنین قابلیت اتصال به فیبرینوژن را حفظ کرده است.

چکیده اهداف: مرگ سلولی برنامه ریزی شده فرایند مهمی است که طی تکامل بدون تغییر باقی مانده است. این فرایند در تنظیم شرایط فیزیولوژیکی و پاتوفیزیولوژیکی موثر است. آپوپتوز شناخته شده_­ترین نوع مرگ سلولی است که در بسیاری از تومورها مختل شده و سبب مقاومت به درمان می شود. کاسپاز9 یکی از پروتئین­های کلیدی مسیر میتوکندریایی آپوپتوز است. فعال شدن کاسپاز9 منجر به فعال شدن کاسپاز­های اجرایی مانند کاسپاز3/۷ شده و با راه اندازی آبشار کاسپازی منجر به مرگ سلول می­­شود. در این مطالعه، ژن کاسپاز9 در وکتور یوکاریوتی pcDNA3.1(+) کلون و عملکرد آن در سلول­ بررسی شد.
مواد و روش­ها: ژن کاسپاز9 طی PCR با پرایمر­های اختصاصی تکثیر و پس از هضم دوگانه با آنزیم­های KpnI و BamHI به پلاسمید pcDNA برش خورده الحاق شد. پلاسمید نوترکیب حاصل پس از تعیین توالی به رده سلولی SH-SY5Y ترنسفکت و با داروی دوکسوروبیسین تیمار شد. عملکرد آن بر مرگ سلولی با روش رنگ آمیزی تریپان بلو و PI، و سنجش فعالیت کاسپاز۳ بررسی و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد.
یافته ها: کلونینگ ژن کاسپاز9 انجام و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد. افزایش بیان کاسپاز۹ در سلول منجر به پردازش خود بخودی آن طی همودایمریزاسیون و در نتیجه القای مرگ سلولی شده و حساسیت سلول نسبت به دوکسوروبیسین را افزایش و زنده مانی سلولی را کاهش داد.
نتیجه گیری: ژن کاسپاز9 کلون شده در سلول فعالیت نشان داد و آپوپتوز را در حضور دوکسوروبیسین از طریق خود فعال­سازی و متعاقبا تشدید فعال­سازی کاسپاز۳ افزایش داد.

چکیده مهارکننده آپوپتوز (IAP) یک خانواده از پروتئین­ها هستند که با مهار فعالیت کاسپاز مرگ سلول را متوقف می­کنند. Survivin کوچکترین پروتئین شناخته شده از این خانواده است که در سلول­های سرطانی مشاهده می­شود اما در بافت­های نرمال بجز بافت جنینی مشاهده نشده است. survivin ممکن است به­عنوان یک مارکر جدید برای شناسایی و درمان سرطان مورد استفاده قرار گیرد. هدف از این پژوهش، کلونینگ ژن survivin در وکتور pET-28a و بیان پروتئین در باکتری E.coli بود.
ژن survivin با روش PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و الگوی pcDNA-survivin تکثیر شد. محصول PCR و پلاسمید pET-28a با آنزیم­های محدودگر HindIII/NheIبرش داده و survivin درون وکتور برش خورده الحاق شد. سپس محصول الحاق شده به باکتری E.coli DH5a ترنسفورم و با استفاده از آنتی بیوتیک کانامایسین غربالگری شد. کلونی­ها با روش PCR ارزیابی شده و پلاسمید کلونی مثبت با روش هضم دوگانه غربالگری شده، در نهایت یک کلونی مثبت با تعیین توالی تایید شد. پلاسمید نوترکیب با روش شیمیایی به باکتری بیانی E.coli (BL21) ترنسفورم شد. بیان survivin در شرایط مختلف انجام و سطح بیان با SDS-PAGE بررسی شد.
اندازه قطعه تکثیرشده توسط PCR با استفاده از ژل آگارز تایید شد. پلاسمید pET-28a برش خورده نیز فعالیت آنزیمی را تایید کرد. قطعه کلون شده پس از توالی­یابی تشابه 100% با survivin انسانی داشت. افزودن IPTG موجب بیان پروتئین survivin در تمام شرایط خصوصا در دمای 37 درجه سانتیگراد از زمان 2 ساعت پس از القا شد اما در تمام شرایط، عمده survivin بیان شده در باکتری به صورت تجمعی بود.

چکیده اعضای خانواده پروتئین‌های شوک حرارتی ۷۰ (Hsp۷۰) از اجزای مرکزی شبکه سلولی چپرون‌های مولکولی و کاتالیزکننده‌های تاخوردگی هستند. ژن کدکننده یک پروتئین مربوط به Hsp۷۰ یا DnaK در حوزه باکتری‌ها dnaK نامیده می‌شود. پروتئین‌های DnaK در تاخوردگی ازنو پروتئین، تشکیل و تفکیک کمپلکس‌های پروتئینی و تخریب پروتئین‌های بدتاخورده دخیل هستند. ژن dnaJ که کدکننده Hsp۴۰ در باکتری‌ها است، با نقش کوچپرونی تنظیم‌کننده فعالیت‌های DnaK است. در این مطالعه، DnaK از باکتری باسیلوس هالودورانس Guj۱ (Bacillus halodurans Guj۱) را شناسایی، کلون و بیان شد. ژن dnaK از باسیلوس هالودورانس Guj۱، با استفاده از سیستم‌ بیانیpET-۲۸a⁺ به‌طور موفقیت‌آمیز در اشریشیا کلی سویه BL۲۱ (DE۳) بیان شد. قالب صحیح خوانش ژن کلون‌شده، دارای ۱۸۳۹جفت‌باز بوده که کدکننده ۶۱۲ باقی‌مانده آمینواسیدی است. وزن مولکولی و pI محاسبه‌شده پروتئین به‌ترتیب ۱۸/۶۶کیلودالتون و ۵۵/۴ است. توالی آمینواسیدی به‌دست‌آمده باسیلوس هالودورانس Guj۱ حدود ۶۰% با همتای خود در E. coli یکسانی دارد. ساختار سه‌بعدی DnaK در باسیلوس هالودورانس با الگو قراردادن ساختار کریستالی BiP (عضوی از خانواده HSP۷۰ در انسان) ساخته شد، که نشان‌دهنده یکسانی ۸۸/۰۸% با هم است. DnaK نوترکیب که توسط تیمار حرارتی به‌طور جزئی خالص شد، در SDS-PAGE یک باند تقریبا ۷۰کیلودالتونی دارد. یافته‌های ما نشان داد که DnaK نوترکیب، بهبوددهنده کارآیی ۲۷% دوباره تاخوردگی کربونیک‌انهیدراز بعد از قرارگیری در °C۵۴ به‌مدت یک‌ساعت است. بنابر نتایج به‌دست‌آمده، DnaK از باسیلوس هالودورانس به‌طور ذاتی می‌تواند به‌منظور بهبود ویژگی‌های عملکردی آنزیم‌ها و پروتئین‌ها، در کاربردهای مختلف استفاده شود.

چکیده کلسیتونین هورمون پپتیدی کوچکی است که در انسان توسط سلول‌های پارافولیکولار تیروئید تولید شده و تنظیم‌کننده متابولیسم کلسیم و فسفر است. کاربرد دارویی کلسیتونین در درمان ناهنجاری‌های مربوط به کلسیم و پوکی استخوان است. به‌علت وزن مولکولی پایین و ناپایداری آن، تولید نوترکیب کلسیتونین با مشکلات زیادی همراه بوده و همچنین تولید در سیستم پروکاریوتی به تیمارهای بعدی برای دستیابی به مولکول بالغ نیاز دارد. اخیراً به توانایی ریزجلبک‌ها در بیان پروتئین‌های نوترکیب توجه زیادی جلب شده است. لذا هدف این تحقیق، مطالعه توانایی Chlamydomonas Reinhardtii در تولید ترشحی کلسیتونین انسانی نوترکیب بود.
مواد و روش‌ها: توالی کدکننده کلسیتونین بهینه‌سازی‌شده به‌همراه توالی راهبر ترشحی کربونیک‌انیدراز در وکتورهای Pchlamy_۳ وPchlamy_۴ کلون شد. پلاسمیدهای نوترکیب به سویه وحشی و سویه واجد دیواره ناقص Chlamydomonas Reinhardtii با روش الکتروپوریشن منتقل شدند. سویه‌های نوترکیب با روش کلنی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز غربالگری شده و سویه‌های منتخب برای تولید کلسیتونین کشت داده شدند. پس از رشد سویه‌ها، محیط کشت جمع‌آوری شده و با روش الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت.
یافته‌ها: وکتور Pchlamy_۳ از قابلیت مناسبی برای بیان توالی هدف برخوردار نبوده و سویه‌های نوترکیب همگی با استفاده از وکتور Pchlamy_۴ حاصل شدند. همچنین سویه وحشی نیز کارآیی مناسبی جهت نوترکیبی نداشته و نوترکیبی فقط در سویه واجد دیواره ناقص دیده شد. میزان کلسیتونین تولیدی در سویه مثبت به‌صورت تقریبی یک پیکوگرم بر میلی‌لیتر محاسبه شد.
نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان می‌دهند که راهبرد به‌کاررفته برای تولید ترشحی کلسیتونین نوترکیب موفقیت‌آمیز بوده و برای مطالعات بعدی قابل استفاده است.

چکیده اهداف: شناخت ساختار و عملکرد پروتئین آلفا- سینوکلئین می‌تواند زمینه‌ساز توسعه روش‌های درمانی مناسب علیه بیماری پارکینسون باشد. هدف پژوهش حاضر، کلون‌کردن DNA و بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در باکتری اشریشیاکلی بود.
مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر، توالی کدکننده آلفا- سینوکلئین موجود در پلازمید نوترکیب pRK۱۷۲، به کمک روش PCR و با استفاده از پرایمرهای مناسب تکثیر شد. DNA سنتزشده توسط آنزیم‌های محدودگر SalI وHindIII بریده و در حامل‌ pET۲۸a کلون و پلازمید نوترکیب به روش کلسیم کلراید به سویه بیانی باکتری اشریشیاکلی (BL۲۱) منتقل شد. بیان آلفا-سینوکلئین توسط محلول IPTG القا و بیان پروتئین نوترکیب با روش الکتروفورز SDS-PAGE ارزیابی شد. ردیف‌سازی توالی‌ها به کمک الگوریتم ClustalW با برنامه BioEdit ۵.۰.۹ صورت پذیرفت.
یافته‌ها: در محصولات واکنش‌های برش آنزیمی DNA و پلازمید pET۲۸a با آنزیم‌های محدودگر، اندازه قطعات، نشان‌دهنده صحت واکنش‌های آنزیمی بود. DNA تکثیرشده و پلازمید pET۲۸a مورد استفاده به‌ترتیب با طول‌های ۴۰۷ و ۵۳۶۹ نوکلئوتید بودند. ترجمه حاصل از توالی قطعه کلون‌شده، تشابه ۱۰۰% با پروتئین آلفا- سینوکلئین انسانی را نشان داد. در بیان پروتئین نوترکیب در قیاس با نمونه‌های شاهد منفی، افزودن IPTG موجب افزایش بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در تمامی نمونه‌ها به‌ویژه ۲ ساعت پس از القا شد. بیشتر آلفا- سینوکلئین بیان‌شده از پلازمید pET۲۸a-alpha-Synuclein به‌صورت اجسام گنجانده در باکتری تجمع یافتند.
نتیجه‌گیری: پروتئین آلفا- سینوکلئین در پلازمید pET۲۸a کلون و تشکیل اجسام گنجانده توسط آلفا- سینوکلئین به‌هنگام بیان از سامانه pET۲۸a-alpha-Synuclein تایید می‌شود و راه را بر تولید این پروتئین در مقیاس بالا هموار می‌سازد.

چکیده گروهی از باکتری‌های همزیست با گیاهان، تحت عنوان PGPR (باکتری های محرک رشد گیاهان) آنزیمی به نام ACC دآمیناز (EC4.1.99.4) را کد می‌کنند که این آنزیم، تنظیم کننده‌ی تولید اتیلن از طریق متابولیزه نمودن ACC (حد واسط بیوسنتز اتیلن) و شکستن آن به آمونیاک و α-کتوبوتیرات می‌باشد. این آنزیم نقش مهمی در تسهیل رشد گیاهان از طریق کاهش میزان اتیلن بخصوص در شرایط سخت محیطی دارد. بنابراین هدف این مطالعه، بیان، تخلیص و تعیین شرایط بهینه‌ی فعالیت آنزیم ACC-دآمیناز (ACCD) از سویه FY32 باکتری سودوموناس فلورسنس و بررسی خصوصیات سینتیکی این آنزیم می‌باشد. بدین منظور، ژن acdS از باکتری سودوموناس فلورسنس بومی جداسازی و در وکتور بیانی pET28 a(+) کلون شد و سپس وکتور نوترکیب pET28-acdS به باکتری E. coli سویه‌ی BL21(DE3) منتقل گردید. پس از مشاهده بیان، آنزیم ACCD توسط ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل-سفاروز تخلیص و سپس، شرایط بهینه‌ی فعالیت این آنزیم و خصوصیات سینتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت. مشخص گردید که این آنزیم، در 7 pH: و دمای 28 درجه سانتی‌گراد بیشترین فعالیت را دارد. این آنزیم فعالیت بالایی را در حضور MgSO4 در مقایسه با سایر یون‌های فلزی مورد مطالعه نشان داد. همچنین کاهش فعالیت آنزیم در غلظت ppm 160 نمک NaCl معنی‌دار بود. با توجه به پارامترهای سینتیکی آنزیم یعنی Km (mM 66/9) و Vmax (nM α-ketobutyrate mg-1 h-1 11/0)، مشخص گردید که کارایی این آنزیم در مقایسه با ACCDهای شناخته شده قبلی نسبتا بالاست.