زیست فناوری

چکیده برای درمان بیماری‌های ایسکمیک، سلول‌درمانی به‌عنوان روشی جدید و مؤثر مطرح است. سلول‌های بنیادی مزانشیمی به دلایل مختلف مانند امکان جداسازی و تکثیر آسان بدون ازدست دادن توانایی تمایزی و تنظیم سامانه ایمنی جایگاه ویژه‌ای دارند. سلول‌های بنیادی پس از تزریق در بافت‌های ایسکمیک با شرایط سخت کمبود اکسیژن رو به رو می‌شوند که با مرگ بیشتر سلول‌ها همراه است. به همین دلیل کارایی سلول درمانی بسیار کاهش می‌یابد. همچنین سرنوشت این سلول‌ها از نظر زنده ماندن و تمایز مورد بحث است. در مطالعات متعددی تأثیر مفید پیش‌آماده‌سازی سلول‌ها با هیپوکسی برای سلول درمانی بافت‌های ایسکمیک گزارش شده است و تنظیم‌کننده‌ی اصلی در این فرایند، فاکتور رونویسی HIF-1α است. در این پژوهش، ژن HIF-1α با استفاده از لنتی‌ویروس‌ها به سلول‌های بنیادی مزانشیمی منتقل می‌شود تا با افزایش بیان آن، شرایط پیش‌آماده‌سازی با هیپوکسی، شبیه‌سازی شود. از طرفی پروتئین eGFP نیز به صورت Bisictronic همراه HIF-1α بیان می‌شود. به این ترتیب هم می‌توان اثر شبیه‌سازی پیش‌آماده‌سازی هیپوکسی روی سلول‌های بنیادی مزانشیمی را بررسی کرد و هم پیگیری و بررسی سرنوشت سلول‌های تزریق‌شده در مدل‌های حیوانی با استفاده از مارکر GFP،انجام می‌شود.

چکیده لنتی ویروسها از جمله موثرترین ویروسهای نوترکیب برای انتقال ژن به سلولها و بافتهای پستانداران بشمار میرود. این مطالعه شامل دو بخش اساسی است: (1) بررسی کارائی ستونهای پروتئینی در تولید لنتی ویروسهای نوترکیب با تیتر بالا و (2) بکارگیری این ستونها درتولید لنتی ویروسهای نوترکیب حامل ژن فاکتورنوروتروفیک GDNF. در بخش اول مطالعه با استفاده از دو ناقل انتقال (حامل GFP یا Jred) تولید لنتی ویروس نوترکیب کردیم. با انتقال سوپرناتان سلولهای ترانسفکت شده به ستونهای پروتئینی Amicon و سانتریفوژ ستونها بیش از 99% سوپرناتان را جدا کردیم تا استوکی در حجم 500 μl از سوپرناتان غلیظ شده و مملو از ویریونها بدست آید. با افزودن رقتهای مختلف این استوک ویروسی به سلولهای هدف، ترانسدوکشن سلولی با موفقیت انجام شد بطوریکه ترانسژنهای گزارشگر در 100% سلولها مشاهده شد. متقابلا تست بخش رقیق سوپرناتان منجر به هیچگونه بیان ژن که نشانگر فعالیت ویروسی باشد نگردید. تولید تیتر بالای ویروسی با روش فیلتراسیون مزبور برای انتقال موفقیت آمیز ژنها اهمیت دارد و از نظر هزینه، حجم کار و زمانبری بر آنها ارجحیت دارد. در بخش دوم این مطالعه، توالی مربوط به فاکتور مهم GDNF را به سازه لنتی ویروسی پیوند زده و به همان روش بالا ویروسهای تیتر بالا تولید کردیم. با انتقال این ویروسها به آستروسیتهای انسانی توانستیم افزایش بیان ژن GDNF را در سطح mRNA بمیزان 3 برابر بدست آوریم. این نتایج نشان دادکه لنتی ویروسهای حامل GDNF را میتوان با روش جاری در تیتر بالا تولید کرده و برای مطالعات تمایزی و حفاظت نورونی مورد استفاده قرار داد.

چکیده لنتی ویروسها از جمله موثرترین ویروسهای نوترکیب برای انتقال ژن به سلولها و بافتهای پستانداران بشمار میرود. در این مطالعه، عملکرد لنتی ویروسهای انسانی را در انتقال ژن خارجی به سلولهای طیور بررسی کردیم. سه ناقل لنتی ویروسی بنامهای ناقل انتقال (ناقل ترانسفر حامل ژن گزارشگر GFP)، ناقل بسته بندی و ناقل غشائی را همزمان به سلولهای مولد ویروس (رده HEK-293T) منتقل کردیم. سوپرناتان سلولهای ترانسفکت شده را پس از 24 و 48 ساعت جمع آوری نموده از فیلتر گذراندیم. سپس آن را به ستونهای پروتئینی Amicon حاوی فیلتر 100 کیلو دالتونی منتقل کرده و بخش اعظم سوپرناتان را با استفاده از سانتریفوژ از نمونه ها جدا کردیم. بدین ترتیب استوکی در حجم 500 µl از سوپرناتان غلیظ شده و مملو از ویریونها را بدست آوردیم. برای ترانسدوکشن سلولهای کبدی جوجه رده LMH رقتهای مختلفی از این استوک ویروسی تغلیظ شده را به محیط کشت این سلولهای در حال رشد اضافه کردیم. 48 ساعت بعد آلودگی سلولی و بیان ترانسژنهای گزارشگر را مشاهده کردیم که میزان بیان آنها 96 ساعت پس از آلودگی به 100% افزایش یافت. نتایج مزبور نشان میدهد که سلولهای با منشاء جوجه را نیز میتوان بوسیله لنتی ویروسهای با منشاء انسانی آلوده ساخت. همچنین با توجه به نیاز به تیتر بالای ویروس برای انتقال موفقیت آمیز ژنها، روش فیلتراسیون تیتر بالایی از ویروس را تولید میکند و از نظر کارایی قابل مقایسه با روشهای سنتی از جمله روش اولتراساتریفوژ بوده و از نظر هزینه، حجم کار و زمانبری بر آنها ارجحیت دارد.