دانشگاه تربیت مدرس زیست فناوری 2322-2115 5 2 2015 02 20 Comparison of constitutive and inducible expression of reteplase, as a recombinant pharmaceutical in Escherichia coli BL21 (DE3)**article uncorrected proof مقایسه بیان دایمی و القایی داروی نوترکیب رتپلاز در میزبان اشریشیاکلی( BL21(DE3 45 53 22311 FA مهرنوش فتحی رودسری دکترای تخصصی ژنتیک،استاد یار پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری عسل اخویان کارشناسی ارشد،پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری نادر مقصودی استاد مرکز تحقیقات علوم اعصاب، هیات علمی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، بلوار دانشجو، اوین، تهران، ایران. Journal Article Tissue plasminogen activator (tPA) is a 65 kDa member of serine protease family. tPA is naturally expressed by endothelial cells of vessels in negligible amounts. The enzyme converts plasminogen to plasmin and results in dissolution of blood clots. Retepalse (Retavase) is a mutated variant of human tPA that lacks a segment of 137 residues. Reteplase is produced in Escherichia coli and lacks post translational modifications including glycosylation. Due to presence of nine disulfide bonds, expression of this protein within bacterial systems is so difficult and mostly results in protein aggregates. Refolding and reactivation of inclusion bodies is an expensive, time-consuming procedure with low efficacy for disulfide-bonded proteins. In the present research we have changed the regulatory sequences to produce active and soluble reteplase enzyme in E. coli BL21 host. Inducible expression of reteplase under the control of T7 promoter resulted in aggregation of proteins in inclusion bodies while the use of a constitutive promoter could produce biologically active reteplase in the cytosol of E. coli cells. فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tPA)، پروتئینی با وزن مولکولی 65 کیلودالتون و از خانواده سرین پروتئازهاست. این پروتئین به طور طبیعی و با مقیاس کم توسط سلولهای اندوتلیال عروق ترشح می شود و تبدیل شدن پلاسمینوژن به پلاسمین و حل شدن لخته های خونی را به عهده دارد. این پروتئین به طور تزریقی در زمان حملات قلبی جهت رفع لخته خونی تجویز می شود. یکی از مشتقات این پروتئین به نام"رتپلاز" نسخه ای جهش یافته از فعال کننده پلاسمینوژن انسانی است که 137 اسید آمینه آن حذف شده است. این دارو در باکتری اشریشیا کلی بیان می شود و فاقد تغییرات پس از ترجمه از جمله گلیکوزیلاسیون می باشد. به دلیل وجود نه باند دی سولفید، بیان این پروتئین در سیستم باکتریایی دارای مشکلات بسیار است و اغلب منجر به ایجاد توده های پروتئینی غیر محلول (inclusion body) می شود. خوردگی مجدد و تبدیل پروتئین غیر فعال به فرم فعال آن فرآیندی طولانی و دشوار است و برای پروتئین های دارای ساختار پیچیده و باندهای دی سولفید متعدد، بازده پایینی دارد. در گزارش حاضر با تغییر ترادف تنظیمی، فرم محلول و فعال آنزیم رتپلاز در باکتری اشریشیاکلی BL21 تولید شده است. بیان القایی رتپلاز تحت کنترل پروموتر T7 منجر به رسوب پروتئین در داخل سلول گردید در حالیکه استفاده از یک پروموتر دایمی با قدرت کمتر، فرم فعال آنزیم را در سیتوزول ایجاد نمود. https://biot.modares.ac.ir/article_22311_01f302980181fb494f4524da6f6e62ea.pdf