دانشگاه تربیت مدرس زیست فناوری 2322-2115 7 2 2016 05 21 Activity optimization of Alicyclobacillus acidocaldarius endoglucanase Cel9A by Response surface methodology (RSM) بهینه سازی فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز Cel9A از باکتری آلیسیکلوباسیلوس اسیدوکالداریوس با روش رویه پاسخ (RSM) 70 80 22339 FA محسن اکبریان دانشجو/ دانشگاه شهید مدنی آذربایجان محمد پاژنگ هیآت علمی گروه سلولی مولکولی دانشگاه شهید مدنی آذربایجان علیرضا امانی قدیم استادیار/ دانشگاه شهید مدنی آذربایجان فرشته سادات یونسی دانشجو/ دانشگاه شهید مدنی آذربایجان Journal Article 1970 01 01 Endoglucanase Cel9A from Alicyclobacillus acidocaldarius (AaCel9A), a thermophile enzyme, randomly breaks β1-4 glycosidic bond between glucose units in cellulose polymer and produces oligosaccharides with reducing end. In this study, first of all, E.coli BL21 cells were transformed by pDEST17 carrying AaCel9A enzyme gene for expression of the recombinant enzyme. After expression, the recombinant enzyme was purified by Ni-NTA affinity chromatography column and the purity of the recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE. Due to impact of the calcium, pH and temperature on AaCel9A activity, the effects of these parameters were investigated on AaCel9A activity to optimize activity condition by using Response surface methodology. The SDS-PAGE result showed that AaCel9A, with molecular weight of 59 kDa, was expressed and purified. Response surface methodology data reveal that the effect of pH on the activity of the enzyme is higher than temperature and the calcium effect is less than temperature. Results showed that the optimum condition of AaCel9A activity reaches at pH 6.35 and 64.5 ˚C as well as 4.92 mM of calcium. Finally, the high correlation between experimental and predicted date indicated that the proposed model for optimizing the enzyme activity has a high accuracy. آنزیم اندوگلوکاناز Cel9A از باکتری آلیسیکلوباسیلوس اسیدوکالداریوس (AaCel9A) یک آنزیم گرمادوست بوده و پیوندهای بتا 1 به 4 را در مولکول سلولز به طور اتفاقی هیدرولیز کرده و الیگوساکاریدهایی با سرهای احیا کننده تولید می‌کند. در این تحقیق ابتدا وکتور pDEST17 حاوی ژن آنزیم AaCel9A جهت بیان پروتئین نوترکیب به میزبان مناسب (اشریشیا کلی سویه BL21) منتقل شده و بعد از بیان، با استفاده از ستون نیکل آگارز خالص گردید. سپس با توجه به تاثیر گذاری pH، دما و کلسیم بر روی فعالیت و پایداری آنزیم، با استفاده از این سه متغییر فعالیت آنزیم با استفاده از روش رویه پاسخ بهینه گردید. نتیجه الکتروفورز ژل SDS-PAGE نشان داد که آنزیم نوترکیب در حدود 59 کیلو دالتون وزن مولکولی داشته و به خوبی بیان و خالص شده است. نتایج روش رویه پاسخ نشان داد که تاثیر pH بر روی فعالیت آنزیم بیشتر از دما، و دما بیشتر از کلسیم بوده و بهینه شرایط فعالیت آنزیم AaCel9A در محیط با 35/6 pH، دمای°C5/64 و غلظت کلسیم برابر با 92/4 مولار است. در نهایت با توجه به همبستگی بالای نتایج آزمایشگاهی و نتایج پیش بینی شده می توان گفت مدل پیشنهادی در این تحقیق برای پیش بینی شرایط بهینه فعالیت آنزیم از صحت بالایی برخوردار است. https://biot.modares.ac.ir/article_22339_900245b439fc98341ca28d3323241e7d.pdf