جستجو در:
دوره 10، شماره 3 - ( 1398 )
جلد 10 شماره 3 صفحات 481-473 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Askari S, Hasannia S, Hasan Sajedi R, Yassaee V. Cloning, Expression, and Purification of Recombinant CEL I Endonuclease in HEK293T Cell Line. JMBS 2019; 10 (3) :473-481
URL: http://biot.modares.ac.ir/article-22-26538-fa.html
URL: http://biot.modares.ac.ir/article-22-26538-fa.html
عسکری سودابه، حسننیا صادق، حسن‌ساجدی رضا، یاسایی وحیدرضا. کلونینگ، بیان و تخلیص اندونوکلئاز CEL I نوترکیب در رده سلولی HEK293T. زیست‌فناوری مدرس. 1398; 10 (3) :473-481
سودابه عسکری1 
، صادق حسننیا* 2، رضا حسن‌ساجدی1 ، وحیدرضا یاسایی
، صادق حسننیا* 2، رضا حسن‌ساجدی1 ، وحیدرضا یاسایی
1- گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران،
2- گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران، تهران، بزرگراه جلال آل احمد، پل نصر، دانشگاه تربیت مدرس ،hasannia@modares.ac.ir
2- گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران، تهران، بزرگراه جلال آل احمد، پل نصر، دانشگاه تربیت مدرس ،
چکیده: (5619 مشاهده)
اندونوکلئاز CEL I، آنزیمی از خانواده S۱ اندونوکلئازها است. این آنزیم، با اختصاصیت بالا، توانایی شناسایی انواع جهش‌ها و جایگزینی بازها در مولکول DNA را دارد که این امر اهمیت آن را در قالب محصولات تجاری به‌منظور مصارف تحقیقاتی و آزمایشگاه‌های بالینی دوچندان می‌کند. اگرچه این آنزیم در گیاه کرفس یافت می‌شود اما به‌دلیل زمان‌بربودن فرآیند استخراج و همچنین بازدهی کم محصول نهایی، استخراج آن مقرون‌به‌صرفه نیست. علاوه بر این، با توجه به لزوم اعمال تغییرات پس از ترجمه برای دست‌یابی به ساختار فعال نهایی، تاکنون گزارشی مبنی بر بیان فرم فعال این آنزیم در میزبان‌های باکتریایی مشاهده نشده است. بنابراین یکی از منابع تولید فرم فعال این آنزیم، کلون و بیان آن در میزبان‌های یوکاریوتی از جمله مخمر و رده‌های سلولی پستانداران است. در این مطالعه، توالی ژن به‌منظور بیان در میزبان یوکاریوتی HEK۲۹۳T بهینهسازی و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزیم‌های KpnI و XhoI در وکتور بیانی pBudCE۴.۱ ساب‌کلون شد. سازه بیانی مورد نظر توسط لیپوفکتامین به رده سلولی HEK۲۹۳T ترانسفکت و بیان پروتئین نوترکیب از طریق روش‌های متعددی از جمله SDS-PAGE، الایزا، واکنش نسخه‌برداری معکوس و وسترن‌بلات تایید شد. آنالیز داده‌های SDS-PAGE و وسترن‌بلات وزن مولکولی در حدود ۳۰کیلو دالتون را تایید کرد. تخلیص با ستون حاوی رزین Ni-NTA انجام و مقدار پروتئین در حدود ۰/۲میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تعیین غلظت شد. درنهایت فعالیت اندونوکلئازی آنزیم، روی DNA هترودوپلکس حاصل از محصول PCR ژن جهش‌یافته و وحشی بررسی شد. نتایج نشان داد که بیان این پروتئین در میزبان HEK۲۹۳T فعالیت مناسبی دارد.
نوع مقاله: پژوهشی اصیل |
موضوع مقاله:
بیوتکنولوژی مولکولی
دریافت: 1397/8/5 | پذیرش: 1397/9/24 | انتشار: 1398/6/30
دریافت: 1397/8/5 | پذیرش: 1397/9/24 | انتشار: 1398/6/30
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |