تولید رده نوترکیب ‌HEK293T‌ با بیش- ‌بیانی پایدار ‌miR-1‎‌ به‌عنوان مدل زیستی ‌برای مطالعات قلبی

نویسندگان

1 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

2 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم، دانشگاه تهران، تهران، ایران

3 گروه ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

4 مرکز تحقیقات نانوبیوتکنولوژی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه‌اله(عج)، تهران، ایران

5 گروه هماتولوژی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده
اهداف: القای مصنوعی بیش- بیان miRNA راهکار مناسبی برای القای موثرتر تمایز سلولی است. نقش موثر miR-۱ در تکوین و تمایز سلول‌های قلبی گزارش شده است. لنتی‌ویروس یک ناقل کارآمد برای تهیه رده‌های سلولی پایدار است. هدف پژوهش حاضر تولید رده سلولی با بیش- بیان پایدار miR-۱ برای ایجاد یک مدل زیستی برای مطالعات قلبی بود.

مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر، سلول‌های HEK ۲۹۳T در محیط کشت DMEM به‌همراه سرم جنین گاوی (FBS) ۱۰% و ال- گلوتامین ۲میلی‌مولار و پنی‌سیلین- استرپتومایسین ۱X در محیط انکوباتور کشت داده شدند. پس از کلون‌کردن ژن miR-۱، کلون‌های نوترکیب انتخاب شدند و حضور قطعه ژنی در وکتور نوترکیب با توالی‌یابی تایید شد. وکتور حامل miR-۱ به‌همراه وکتورهای کمکی در سلولHEK۲۹۳T به‌صورت ویروس نوترکیب بسته‌بندی شد. تراآلایی سلول‌های HEK۲۹۳T با ویروس نوترکیب برای تولید رده پایدار انجام شد. سپس کارآیی تراآلایی و رقت موثر ویروس با نشانگر GFP سنجش شد. تغییرات بیان miR-۱ با روش qPCR بررسی شد. تحلیل داده‌ها از طریق بررسی مقایسه‌ای چرخه آستانه و روش Pfaffl انجام گرفت.

یافته‌ها: بیشترین میزان بیان GFP مربوط به سلول‌های آلوده‌شده با رقت ۱۵۰میکرومولار بود. نشانگر فلورسنت GFP موجب تسهیل فرآیند بهینه‌سازی و تخلیص سلول‌های نوترکیب شد. در ارزیابی qPCR، بیان miR-۱ در سلول‌های تراآلایی شده در مقایسه با سلول‌های گروه کنترل افزایش قابل ملاحظه‌ای داشت.

نتیجه‌گیری: رده سلولی پایدار نوترکیب HEK۲۹۳T بیش- بیان‌کننده miR-۱ در لنتی‌ویروس، به‌عنوان مدل زیستی مناسب برای بررسی فرآیندهای تکامل و تکوین قلب است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


‎Karunakaran D, Rayner KJ. MicroRNAs in cardiovascular health: From order to disorder. Endocrinology. ‎‎2013;154(11):4000-9.‎ [Link] [DOI:10.1210/en.2013-1299]
‎Jackson A L, Levin AA. Developing microRNA therapeutics: Approaching the unique complexities. Nucleic ‎Acid Ther. 2012;22(4):213-25.‎ [Link]
Hertel J, Langenberger D, Stadler PF. Computational prediction of microRNA genes. Methods Mol Biol. ‎‎2014;1097:437-56.‎ [Link] [DOI:10.1007/978-1-62703-709-9_20]
Thomson DW, Bracken CP, Goodall GJ. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic ‎Acids Res. 2011;39(16):6845-53.‎ [Link]
Creemers EE, Tijsen AJ, Pinto YM. Circulating microRNAs: Novel biomarkers and extracellular ‎communicators in cardiovascular disease?. Circ Res. 2012;110(3):483-95.‎ [Link] [DOI:10.1161/CIRCRESAHA.111.247452]
‎Lovat F, Valeri N, Croce CM. MicroRNAs in the pathogenesis of cancer. Semin Oncol. 2011;38(6):724-33.‎ [Link] [DOI:10.1053/j.seminoncol.2011.08.006]
Ajami M, Atashi A, Soleimani M, Ajami M, Kaviani S. Comparison of miR-24, miR-106aand miR-107 ‎expression in identical twins of different ages. J Zanjan Univ Med Sci Health Serv. 2015;23(96):22-33. ‎‎[Persian]‎ [Link]
Bakhshandeh B, Soleimani M, Hafizi M, Paylakhi SH, Ghaemi N. MicroRNA signature associated with ‎osteogenic lineage commitment. Mol Biol Rep. 2012;39(7):7569-81.‎ [Link] [DOI:10.1007/s11033-012-1591-2]
Bakhshandeh B, Soleimani M, Paylakhi SH, Ghaemi N. A microRNA signature associated with chondrogenic ‎lineage commitment. J Genet. 2012;91(2):171-82.‎ [Link] [DOI:10.1007/s12041-012-0168-0]
Bakhshandeh B, Hafizi M, Ghaemi N, Soleimani M. Down-regulation of miRNA-221 triggers osteogenic ‎differentiation in human stem cells. Biotechnol Lett. 2012;34(8):1579-87.‎ [Link] [DOI:10.1007/s10529-012-0934-3]
Cai B, Pan Z, Lu Y. The roles of microRNAs in heart diseases: A novel important regulator. Curr Med ‎Chem. 2010;17(5):407-11.‎ [Link]
Silvestri P, Di Russo C, Rigattieri S, Fedele S, Todaro D, Ferraiuolo G, et al. MicroRNAs and ischemic heart ‎disease: Towards a better comprehension of pathogenesis, new diagnostic tools and new therapeutic targets. ‎Recent Pat Cardiovasc Drug Discov. 2009;4(2):109-18.‎ [Link]
Malizia AP, Wang DZh. MicroRNAs in cardiomyocyte development. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. ‎‎2011;3(2):183-90.‎ [Link]
Li J, Dong X, Wang Zh, Wu J. MicroRNA-1 in cardiac diseases and cancers. Korean J Physiol Pharmacol. ‎‎2014;18(5):359-63.‎ [Link] [DOI:10.4196/kjpp.2014.18.5.359]
Chen JF, Mandel EM, Thomson JM, Wu Q, Callis TE, Hammond SM, et al. The role of microRNA-1 and ‎microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation. Nat Genet. 2006;38(2):228-33.‎ [Link]
Jayawardena TM, Egemnazarov B, Finch EA, Zhang L, Payne JA, Pandya K, et al. MicroRNA-mediated in ‎vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. ‎‎2012;110(11):1465-73.‎ [Link]
Mahmoodzadeh A, Pourfatollah A, Karimi M, Moazzeni S. Induction of tolerogenic murine dendritic cells ‎by downregulating the co-stimulatory molecule of cd40 using lentivirus vector. J Zanjan Univ Med Sci Health ‎Serv. 2014;22(94):1-10. [Persian]‎ [Link]
Zhao Y, Ransom JF, Li A, Vedantham V, von Drehle M, Muth AN, et al. Dysregulation of cardiogenesis, ‎cardiac conduction, and cell cycle in mice lacking miRNA-1-2. Cell. 2007;129(2):303-17.‎ [Link]
Ranji N, Sadeghizadeh M, Shokrgozar MA, Bakhshandeh B, Karimipour M, Amanzadeh A, et al. MiR-17-‎‎92 cluster: An apoptosis inducer or proliferation enhancer. Mol Cell Biochem. 2013;380(1-2):229-38.‎ [Link]
Metcalf D, Carpinelli MR, Hyland C, Mifsud S, Dirago L, Nicola NA, et al. Anomalous megakaryocytopoiesis ‎in mice with mutations in the c-Myb gene. Blood. 2005;105(9):3480-7.‎ [Link]
Lo KW, Ashe KM, Kan HM, Laurencin CT. The role of small molecules in musculoskeletal regeneration. ‎Regen Med. 2012;7(4):535-49.‎ [Link] [DOI:10.2217/rme.12.33]
Ahvaz HH, Soleimani M, Mobasheri H, Bakhshandeh B, Shakhssalim N, Soudi S, et al. Effective ‎combination of hydrostatic pressure and aligned nanofibrous scaffolds on human bladder smooth muscle ‎cells: Implication for bladder tissue engineering. J Mater Sci Mater Med. 2012;23(9):2281-90.‎ [Link]
Scarritt ME, Pashos NC, Bunnell BA. A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole ‎organs. Front Bioeng Biotechnol. 2015;3:43.‎ [Link]
Bakhshandeh B, Soleimani M, Hafizi M, Ghaemi N. A comparative study on nonviral genetic modifications ‎in cord blood and bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 2012;64(5):523-40.‎ [Link] [DOI:10.1007/s10616-012-9430-9]
Halff EF, Versteeg M, Brondijk TH, Huizinga EG. When less becomes more: Optimization of protein ‎expression in HEK293-EBNA1 cells using plasmid titration - a case study for NLRs. Protein Expr Purif. ‎‎2014;99:27-34.‎ [Link] [DOI:10.1016/j.pep.2014.03.010]
Huang F, Tang L, Fang ZhF, Hu XQ, Pan JY, Zhou ShH. MiR-1-mediated induction of cardiogenesis in ‎mesenchymal stem cells via downregulation of Hes-1. BioMed Res Int. 2013;2013: ID 216286.‎ [Link]
Wang TY, Zhang QQ, Zhang X, Sun QL, Zhao CP, Wang XY. The effect of recombinant lentiviral vector ‎encoding miR-145 on human esophageal cancer cells. Tumour Biol. 2015;36(12):9733-8.‎ [Link] [DOI:10.1007/s13277-015-3743-1]
So KH, Han YJ, Park HY, Kim JG, Sung DJ, Bae YM, et al. Generation of functional cardiomyocytes from ‎mouse induced pluripotent stem cells. Int J Cardiol. 2011;153(3):277-85.‎ [Link]
Ohta S, Imaizumi Y, Okada Y, Akamatsu W, Kuwahara R, Ohyama M, et al. Generation of human ‎melanocytes from induced pluripotent stem cells. PLoS One. 2011;6(1):e16182.‎ [Link]