کلون‌کردن DNA و بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در باکتری اشریشیاکلی

نویسندگان

گروه زیست‌شناسی سلولی- ملکولی، دانشکده زیست‌شناسی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده
اهداف: شناخت ساختار و عملکرد پروتئین آلفا- سینوکلئین می‌تواند زمینه‌ساز توسعه روش‌های درمانی مناسب علیه بیماری پارکینسون باشد. هدف پژوهش حاضر، کلون‌کردن DNA و بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در باکتری اشریشیاکلی بود.

مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر، توالی کدکننده آلفا- سینوکلئین موجود در پلازمید نوترکیب pRK۱۷۲، به کمک روش PCR و با استفاده از پرایمرهای مناسب تکثیر شد. DNA سنتزشده توسط آنزیم‌های محدودگر SalI وHindIII بریده و در حامل‌ pET۲۸a کلون و پلازمید نوترکیب به روش کلسیم کلراید به سویه بیانی باکتری اشریشیاکلی (BL۲۱) منتقل شد. بیان آلفا-سینوکلئین توسط محلول IPTG القا و بیان پروتئین نوترکیب با روش الکتروفورز SDS-PAGE ارزیابی شد. ردیف‌سازی توالی‌ها به کمک الگوریتم ClustalW با برنامه BioEdit ۵.۰.۹ صورت پذیرفت.

یافته‌ها: در محصولات واکنش‌های برش آنزیمی DNA و پلازمید pET۲۸a با آنزیم‌های محدودگر، اندازه قطعات، نشان‌دهنده صحت واکنش‌های آنزیمی بود. DNA تکثیرشده و پلازمید pET۲۸a مورد استفاده به‌ترتیب با طول‌های ۴۰۷ و ۵۳۶۹ نوکلئوتید بودند. ترجمه حاصل از توالی قطعه کلون‌شده، تشابه ۱۰۰% با پروتئین آلفا- سینوکلئین انسانی را نشان داد. در بیان پروتئین نوترکیب در قیاس با نمونه‌های شاهد منفی، افزودن IPTG موجب افزایش بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در تمامی نمونه‌ها به‌ویژه ۲ ساعت پس از القا شد. بیشتر آلفا- سینوکلئین بیان‌شده از پلازمید pET۲۸a-alpha-Synuclein به‌صورت اجسام گنجانده در باکتری تجمع یافتند.

نتیجه‌گیری: پروتئین آلفا- سینوکلئین در پلازمید pET۲۸a کلون و تشکیل اجسام گنجانده توسط آلفا- سینوکلئین به‌هنگام بیان از سامانه pET۲۸a-alpha-Synuclein تایید می‌شود و راه را بر تولید این پروتئین در مقیاس بالا هموار می‌سازد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Goldstein DS, Sewell L, Holmes C. Association of anosmia with autonomic failure in Parkinson disease. Neurology. 2010;74(3):245-51. [Link] [DOI:10.1212/WNL.0b013e3181ca014c]
Park A, Stacy M. Non-motor symptoms in Parkinson's disease. J Neurol. 2009;256(Suppl 3):293-8. [Link] [DOI:10.1007/s00415-009-5240-1]
Wullner U, Schmitz-Hubsch T, Antony G, Fimmers R, Spottke A, Oertel WH, et al. Autonomic dysfunction in 3414 Parkinson's disease patients enrolled in the German Network on Parkinson's disease (KNP e.V.): The effect of ageing. Eur J Neurol. 2007;14(12):1405-8. [Link] [DOI:10.1111/j.1468-1331.2007.01982.x]
Reichmann H. Clinical criteria for the diagnosis of Parkinson's disease. Neurodegener Dis. 2010;7(5):284-90. [Link] [DOI:10.1159/000314478]
Braak H, Bohl JR, Muller CM, Rub U, de Vos RA, Del Tredici K. Stanley Fahn Lecture 2005: The staging procedure for the inclusion body pathology associated with sporadic Parkinson's disease reconsidered. Mov Disord. 2006;21:2042-51. [Link] [DOI:10.1002/mds.21065]
Shults CW. Lewy bodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(6):1661-8. [Link] [DOI:10.1073/pnas.0509567103]
Spillantini MG, Crowther RA, Jakes R, Hasegawa M, Goedert M. alpha-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with lewy bodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(11):6469-73. [Link] [DOI:10.1073/pnas.95.11.6469]
Olanow CW, Tatton WG. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annu Rev Neurosci. 1999;22:123-44. [Link] [DOI:10.1146/annurev.neuro.22.1.123]
Martin I, Dawson VL, Dawson TM. Recent advances in the genetics of Parkinson's disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2011;12:301-25. [Link] [DOI:10.1146/annurev-genom-082410-101440]
Ozansoy M, Basak AN. The central theme of Parkinson's disease: Alpha-synuclein. Mol Neurobiol. 2013;47(2):460-5. [Link] [DOI:10.1007/s12035-012-8369-3]
Bruinsma IB, Bruggink KA, Kinast K, Versleijen AA, Segers-Nolten IM, Subramaniam V, et al. Inhibition of alpha-synuclein aggregation by small heat shock proteins. Proteins. 2011;79(10):2956-67. [Link] [DOI:10.1002/prot.23152]
Buchman VL, Hunter HJ, Pinon LG, Thompson J, Privalova EM, Ninkina NN, et al. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. J Neurosci. 1998;18(22):9335-41. [Link] [DOI:10.1523/JNEUROSCI.18-22-09335.1998]
Lavedan C, Leroy E, Dehejia A, Buchholtz S, Dutra A, Nussbaum RL, Polymeropoulos MH. Identification, localization and characterization of the human gamma-synuclein gene. Hum Genet. 1998;103(1):106-12. [Link] [DOI:10.1007/s004390050792]
Maroteaux L, Scheller RH. The rat brain synucleins; family of proteins transiently associated with neuronal membrane. Brain Res Mol Brain Res. 1991;11(3):335-43. [Link] [DOI:10.1016/0169-328X(91)90043-W]
Shibasaki Y, Baillie DA, St Clair D, Brookes AJ. High-resolution mapping of SNCA encoding alpha-synuclein, the non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid precursor, to human chromosome 4q21.3-->q22 by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1995;71(1):54-5. [Link] [DOI:10.1159/000134061]
Biskup S, Gerlach M, Kupsch A, Reichmann H, Riederer P, Vieregge P, et al. Genes associated with Parkinson syndrome. J Neurol. 2008;255(Suppl 5):8-17. [Link] [DOI:10.1007/s00415-008-5005-2]
Loov C, Scherzer CR, Hyman BT, Breakefield XO, Ingelsson M. Alpha-synuclein in extracellular vesicles: Functional implications and diagnostic opportunities. Cell Mol Neurobiol. 2016;36(3):437-48. [Link] [DOI:10.1007/s10571-015-0317-0]
Fink AL. The aggregation and fibrillation of alpha-synuclein. Acc Chem Res. 2006;39(9):628-34. [Link] [DOI:10.1021/ar050073t]
Lee MK, Stirling W, Xu Y, Xu X, Qui D, Mandir AS, et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(13):8968-73. [Link] [DOI:10.1073/pnas.132197599]
Periquet M, Fulga T, Myllykangas L, Schlossmacher MG, Feany MB. Aggregated alpha-synuclein mediates dopaminergic neurotoxicity in vivo. J Neurosci. 2007;27(12):3338-46. [Link] [DOI:10.1523/JNEUROSCI.0285-07.2007]
Ueda K, Fukushima H, Masliah E, Xia Y, Iwai A, Yoshimoto M, et al. Molecular cloning of cDNA encoding an unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90(23):11282-6. [Link] [DOI:10.1073/pnas.90.23.11282]
Neve RL, Selkoe DJ, Kurnit DM, Kosik KS. A cDNA for a human microtubule associated protein 2 epitope in the Alzheimer neurofibrillary tangle. Brain Res. 1986;387(2):193-6. [Link] [DOI:10.1016/0169-328X(86)90011-2]
Jakes R, Spillantini MG, Goedert M. Identification of two distinct synucleins from human brain. FEBS Lett. 1994;345(1):27-32. [Link] [DOI:10.1016/0014-5793(94)00395-5]
Narhi L, Wood SJ, Steavenson S, Jiang Y, Wu GM, Anafi D, et al. Both familial Parkinson's disease mutations accelerate alpha-synuclein aggregation. J Biol Chem. 1999;274(14):9843-6. [Link] [DOI:10.1074/jbc.274.14.9843]
Choi JY, Sung YM, Park HJ, Hur EH, Lee SJ, Hahn C, et al. Rapid purification and analysis of alpha-synuclein proteins: C-terminal truncation promotes the conversion of alpha-synuclein into a protease-sensitive form in Escherichia coli. Biotechnol Appl Biochem. 2002;36(Pt 1):33-40. [Link] [DOI:10.1042/BA20020004]
Bisaglia M, Trolio A, Tessari I, Bubacco L, Mammi S, Bergantino E. Cloning, expression, purification, and spectroscopic analysis of the fragment 57-102 of human alpha-synuclein. Protein Expr Purif. 2005;39(1):90-6. [Link] [DOI:10.1016/j.pep.2004.09.018]
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994;22(22):4673-80. [Link] [DOI:10.1093/nar/22.22.4673]
Hall TA. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp Ser. 1999;41:95-8. [Link]
Huang C, Ren G, Zhou H, Wang CC. A new method for purification of recombinant human alpha-synuclein in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2005;42(1):173-7. [Link] [DOI:10.1016/j.pep.2005.02.014]
Weinreb PH, Zhen W, Poon AW, Conway KA, Lansbury PT Jr. NACP, a protein implicated in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 1996;35(43):13709-15. [Link] [DOI:10.1021/bi961799n]
Uversky VN, Li J, Fink AL. Evidence for a partially folded intermediate in alpha-synuclein fibril formation. J Biol Chem. 2001;276(14):10737-44. [Link] [DOI:10.1074/jbc.M010907200]
Hashimoto M, Hsu LJ, Sisk A, Xia Y, Takeda A, Sundsmo M, et al. Human recombinant NACP/alpha-synuclein is aggregated and fibrillated in vitro: Relevance for Lewy body disease. Brain Res. 1998;799(2):301-6. [Link] [DOI:10.1016/S0006-8993(98)00514-9]
De Groot NS, Ventura S. Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies. FEBS Lett. 2006;580(27):6471-6. [Link] [DOI:10.1016/j.febslet.2006.10.071]
Iljina, M, Garcia GA, Horrocks MH, Tosatto, L, Choi, ML, Ganzinger KA, et al. Kinetic model of the aggregation of alpha-synuclein provides insights into prion-like spreading. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(9):E1206-15. [Link] [DOI:10.1073/pnas.1524128113]
Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 2014;(17)5:172. [Link] [DOI:10.3389/fmicb.2014.00172]