بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات دومین متصل‌شونده به IP3 نوع 2 انسانی

نویسندگان

گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده
اهداف: IP۳ یک مولکول کلیدی تنظیم‌کننده در مسیر انتقال پیام است و با اتصال به گیرنده‌های درون‌سلولی IP۳R روی سطح ذخایر کلسیم داخل‌سلولی باعث آزادسازی کلسیم به درون سیتوپلاسم می‌شود. هدف این پژوهش، بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات دومین متصل‌شونده به IP۳ )IP۳BD:۱-۶۰۴ aa( نوع ۲ انسانی بود.

مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر، پلاسمید pET-۲۸a حامل ژن IP۳BD با روش شیمیایی به داخل باکتری‌های بیانی E.coli سویه BL۲۱) DE۳( منتقل شد. برای بهینه‌سازی بیان در سیستم باکتریایی، بیان در شرایط مختلف مورد بررسی قرار گرفت و دماهای بیان مختلف از جمله ۱۶، ۱۸، ۲۰ و C۲۴
º، زمان‌های مختلف بعد از القا، نوع القاکننده و غلظت‌های مختلف آن بررسی شد. باکتری‌های القاشده براساس شوک حرارتی از طریق کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل- سفارز تخلیص و میزان خلوص پروتئین از طریق SDS-PAGE بررسی شد. نشر فلورسانس دومین متصل‌شونده به IP۳ در حضور و عدم حضور لیگاند IP۳ در طول موج ۲۹۵نانومتر اندازه‌گیری شد.

یافته‌ها: پروتئین در محیط‌های LB و TB و ۲xYT بیان قابل توجهی نداشت و در زمان‌های مختلف تغییری در آن مشاهده نشد. بیان پروتئین باکتری در دمای C۲۰
º براساس شوک حرارتی C۴۲º نسبت به تمام حالات بیشتر بود. تخلیص باکتری‌های القاشده براساس شوک حرارتی به‌سختی تکرار می‌شد و نمونه‌های خالص‌شده نیز غلظت بالایی نداشتند. نشر فلورسانس پروتئین در حضور لیگاند IP۳ کاهش یافت.

نتیجه‌گیری: بیان باکتریایی دومین متصل‌شونده به IP۳ از گیرنده نوع ۲ گونه انسانی ضعیف است، ولی با القای شوک C۴۲
º بیان پروتئین تا حدود نسبتاً زیادی افزایش می‌یابد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Berridge MJ. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 1993;361(6410):315-25. [Link] [DOI:10.1038/361315a0]
Berridge MJ. Cell signalling. A tale of two messengers. Nature. 1993;365(6445):388-9. [Link] [DOI:10.1038/365388a0]
Maeda N, Niinobe M, Mikoshiba K. A cerebellar Purkinje cell marker P400 protein is an inositol 1,4,5-trisphosphate (InsP3) receptor protein. Purification and characterization of InsP3 receptor complex. EMBO J. 1990;9(1):61-7. [Link] [DOI:10.1002/j.1460-2075.1990.tb08080.x]
Koga T, Yoshida Y, Cai JQ, Islam MO, Imai S. Purification and characterization of 240-kDa cGMP-dependent protein kinase substrate of vascular smooth muscle. Close resemblance to inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. J Biol Chem. 1994;269(15):11640-7. [Link]
O'Rourke F, Matthews E, Feinstein MB. Purification and characterization of the human type 1 Ins(1,4,5)P3 receptor from platelets and comparison with receptor subtypes in other normal and transformed blood cells. Biochem J. 1995;312(Pt 2):499-503. [Link] [DOI:10.1042/bj3120499]
Mignery GA, Newton CL, Archer BT 3rd, Südhof TC. Structure and expression of the rat inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. J Biol Chem. 1990;265(21):12679-83. [Link]
Yamamoto-Hino M, Sugiyama T, Hikichi K, Mattei MG, Hasegawa K, Sekine S, et al. Cloning and characterization of human type 2 and type 3 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. Receptors channels. 1994;2(1):9-22. [Link]
Maranto AR. Primary structure, ligand binding, and localization of the human type 3 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor expressed in intestinal epithelium. J Biol Chem. 1994;269(2):1222-30. [Link]
De Smedt H, Missiaen L, Parys JB, Bootman MD, Mertens L, Van Den Bosch L, et al. Determination of relative amounts of inositol trisphosphate receptor mRNA isoforms by ratio polymerase chain reaction. The J biol chem. 1994;269(34):21691-8. [Link]
Taylor CW, Da Fonseca PCA, Morris EP. IP3 receptors: The search for structure. Trends biochem sci. 2004;29(4):210-9. [Link] [DOI:10.1016/j.tibs.2004.02.010]
Furuichi T, Simon-Chazottes D, Fujino I, Yamada N, Hasegawa M, Miyawaki A, et al. Widespread expression of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 gene (Insp3r 1) in the mouse central nervous system. Receptors channels. 1993;1(1):11-24. [Link]
Yoshida Y, Imai S. Structure and function of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor. Jpn J pharmacol. 1997;74(2):125-37. [Link] [DOI:10.1254/jjp.74.125]
Bosanac I, Alattia JR, Mal TK, Chan J, Talarico S, Tong FK, et al. Structure of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor binding core in complex with its ligand. Nature. 2000;420(6916):696-700. [Link] [DOI:10.1038/nature01268]
Ataei F, Torkzadeh-Mahani M, Hosseinkhani S. A novel luminescent biosensor for rapid monitoring of IP3 by split-luciferase complementary assay. Biosens Bioelectron. 2013;41:642-8. [Link] [DOI:10.1016/j.bios.2012.09.037]
Arsène F, Tomoyasu T, Bukau B. The heat shock response of Escherichia coli. Int J Food Microbiol. 2000;55(1-3):3-9. [Link] [DOI:10.1016/S0168-1605(00)00206-3]