شناسایی آپتامر DNAای با تمایل بالا علیه آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B با روش تکامل سیستماتیک لیگاند از طریق غنی‌سازی نمایی

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده مهندسی شیمی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

2 مرکز تحقیقات پروتئین، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

3 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده فناوری‌های نوین، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

4 گروه نانوبیوتکنولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده
اهداف: هپاتیت B عفونت ویروسی است که می‌تواند منجر به مشکلات جدی کبدی شود. برای تولید واکسن هپاتیت B از آنتی‌‌ژن سطحی ویروس هپاتیت B (HBsAg) که به‌صورت نوترکیب تولید می‌شود، استفاده می‌شود. هدف پژوهش حاضر شناسایی آپتامر DNAای با تمایل بالا علیه آنتی‌ژن سطحی هپاتیت B با روش تکامل سیستماتیک لیگاند با استفاده از غنی‌سازی نمایی بود.

مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر با استفاده از روش تکامل سیستماتیک لیگاند از طریق غنی‌سازی نمایی (​
SELEX( قطعه DNAای با قدرت اتصال بالا علیه HBsAg، جداسازی و توالی‌یابی شد. تمایل این توالی نوکلئوتیدی تک‌رشته‌ای با روش فلوریمتری محاسبه شد. اختلاف جذب اولیه و مقدار باقی‌مانده به‌عنوان معیاری از میزان توالی‌های متصل‌شده با کمک نرم‌افزار Prism ۵ به روش رگرسیون غیرخطی، محاسبه Binding-saturation و مدل one site-total انجام و میزان میل ترکیبی (Kd) تعیین شد.

یافته‌ها: نتایج بعد از انجام رویه SELEX و ارزیابی توالی تکثیریافته با ژل آگارز، نمونه کنترل مثبت دارای باندی در محدوده ۷۲نوکلئوتید بود که نشان‌دهنده تکثیر موفق توالی گزینش‌شده با استفاده از آغازگزهای انتخابی بود. میل ترکیبی محاسبه‌شده ۸۱/۵۳نانومولار بود. طی مراحل همسانه‌سازی از روی کلنی‌های موجود واکنش PCR با آغازگرهای اختصاصی آپتامر، حضور قطعه آپتامر در باکتری اشریشیا کلی تایید شد. آپتامر گزارش‌شده دارای ساختار ثانویه پایدار با داشتن انرژی آزاد GΔ کمتر از ۹/۶-کیلوژول و Tm بالاتر از C°۴۵ بود.

نتیجه‌گیری: آپتامر DNAای گزینش‌شده دارای قدرت اتصال بالا به پروتئین هدف (
HbsAg) است و می‌تواند به‌عنوان جایگزینی برای پادتن‌ها، در ستون‌های کروماتوگرافی تمایلی تخلیص HBsAg مورد توجه قرار بگیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Huang Y, Bi J, Zhang Y, Zhou W, Li Y, Zhao L, Su Z. A highly efficient integrated chromatographic procedure for the purification of recombinant hepatitis B surface antigen from Hansenula polymorpha. Protein Expr Purif. 2007;56(2):301-10. [Link] [DOI:10.1016/j.pep.2007.08.009]
Tleugabulova D, Falcón V, Sewer M, Pentón E. Aggregation of recombinant hepatitis B surface antigen in Pichia pastoris. J chromatogr B Biome Sci Appl. 1998;716(1-2):209-19. [Link]
Safarik I, Safarikova M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2004;2:7. [Link] [DOI:10.1186/1477-044X-2-7]
Janson JC, editor. Protein purification: Principles, high resolution methods, and applications. Volume 54. 3th Edition. Hoboken: Wiley-VCH; 2012. [Link]
Zhao Q, Wu M, Chris Le X, Li XF. Applications of aptamer affinity chromatography. TrAC Trends Anal Chem. 2012;41:46-57. [Link] [DOI:10.1016/j.trac.2012.08.005]
Tombelli S, Mascini M. Aptamers as molecular tools for bioanalytical methods. Curr Opin Mol Ther. 2009;11(2):179-88. [Link]
Deng Q, Watson CJ, Kennedy RT. Aptamer affinity chromatography for rapid assay of adenosine in microdialysis samples collected in vivo. J Chromatogr A. 2003;1005(1-2):123-30. [Link] [DOI:10.1016/S0021-9673(03)00812-4]
Darmostuk M, Rimpelova S, Gbelcova H, Ruml T. Current approaches in SELEX: An update to aptamer selection technology. Biotechnol Adv. 2015;33(6 pt2):1141-61. [Link] [DOI:10.1016/j.biotechadv.2015.02.008]
Connor AC, McGown LB. Aptamer stationary phase for protein capture in affinity capillary chromatography. J Chromatogr A. 2006;1111(2):115-9. [Link] [DOI:10.1016/j.chroma.2005.05.012]
Ravelet C, Peyrin E. Aptamers in affinity separations: Stationary separation. In: Li Y, Lu Y, editors. Functional nucleic acids for analytical applications, integrated analytical systems. New York: Springer; 2009. pp. 271-86. [Link] [DOI:10.1007/978-0-387-73711-9_10]
Proske D, Blank M, Buhmann R, Resch A. Aptamers--basic research, drug development, and clinical applications. Appl Microbiol Biotechnol. 2005;69(4):367-74. [Link] [DOI:10.1007/s00253-005-0193-5]
Smith BJ. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods Mol Biol. 1984;1:41-55. [Link] [DOI:10.1385/0-89603-062-8:41]
Stoltenburg R, Reinemann C, Strehlitz B. SELEX--a (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol Eng. 2007;24(4):381-403. [Link] [DOI:10.1016/j.bioeng.2007.06.001]
Liu Y, Wang C, Li F, Shen S, Tyrrell DL, Le XC, Li XF. DNase-mediated single-cycle selection of aptamers for proteins blotted on a membrane. Anal Chem. 2012;84(18):7603-6. [Link] [DOI:10.1021/ac302047e]
Svobodova, M, Pinto A, Nadal P, O'Sullivan CK. Comparison of different methods for generation of single-stranded DNA for SELEX processes. Anal Bioanal Chem. 2012;404(3), 835-842. [Link] [DOI:10.1007/s00216-012-6183-4]
Marimuthu C, Tang TH, Tominaga J, Tan SC, Gopinath SC. Single-stranded DNA (ssDNA) production in DNA aptamer generation. Analyst. 2012;137(6):1307-15. [Link] [DOI:10.1039/c2an15905h]
Tautz D, Renz M. An optimized freeze-squeeze method for the recovery of DNA fragments from agarose gels. Anal Biochem. 1983;132(1):14-9. [Link] [DOI:10.1016/0003-2697(83)90419-0]
Liu J, Yang Y, Hu B, Ma ZY, Huang HP, Yu Y, et al. Development of HBsAg-binding aptamers that bind HepG2. 2.15 cells via HBV surface antigen. Virol Sin. 2010;25(1):27-35. [Link] [DOI:10.1007/s12250-010-3091-7]
Xi Z, Huang R, Li Z, He N, Wang T, Su E, et al. Selection of HBsAg-specific DNA aptamers based on carboxylated magnetic nanoparticles and their application in the rapid and simple detection of hepatitis B virus infection. ACS appl mater interfaces. 2015;7(21):11215-23. [Link] [DOI:10.1021/acsami.5b01180]
Orabi A, Bieringer M, Geerlof A, Bruss V. An aptamer against the matrix binding domain on the hepatitis B virus capsid impairs virion formation. J virol. 2015;89(18):9281-7. [Link] [DOI:10.1128/JVI.00466-15]