افزایش پایداری حرارتی پروتئین نوترکیب اینورتاز ساکارومایسس سرویزیه با ایجاد جهش‌های هدفمند

نویسندگان

مرکز تحقیقات پروتئین، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

چکیده
اهداف: اینورتاز آنزیمی است که به‌صورت گسترده در صنایع مورد استفاده قرار می‌گیرد. منبع اصلی تولید صنعتی آنزیم اینورتاز مخمر ساکارومایسس سرویزیه است. افزایش پایداری حرارتی در این آنزیم کمک مهمی به افزایش بهره‌وری در تولید مربوطه خواهد کرد. هدف پژوهش حاضر افزایش پایداری حرارتی پروتئین نوترکیب اینورتاز ساکارومایسس سرویزیه با ایجاد جهش‌های هدفمند بود.

مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر، با الگوقراردادن آنزیم اینورتاز باکتری گرمادوست ترماتوگا ماریتیما به‌منظور افزایش پایداری حرارتی، اسیدآمینه‌های ترئونین ۳۴۵ و آسپارژین ۳۴۹ در ژن پروتئین اینورتاز ساکارومایسس سرویزیه با روش جهش‌زایی هدفمند با آلانین جایگزین و در مخمر پیکیا پاستوریس همسانه‌سازی با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز SOEing انجام شد. فعالیت آنزیم‌های نوترکیب اینورتاز طبیعی و جهش‌یافته در دماهای مختلف، pHهای مختلف، مدت‌زمان پایداری و پایداری حرارتی- عملکردی اندازه‌گیری و نمودار میکائیلیس- منتن رسم شد.

یافته‌ها: پایداری حرارتی- ساختاری آنزیم‌های طبیعی و جهش‌یافته اینورتاز در دمای
۵۵ºC نشان داد که آنزیم جهش‌یافته در دمای ۵۵ºC نسبت به آنزیم طبیعی پایدرای حرارتی بالاتری داشت. هر دو آنزیم طبیعی و جهش‌یافته در پایداری عملکردی روند مشابهی را نشان دادند. کاهش Km و افزایش Vmax در سوبسترای ساکاروز و افزایش ۵برابری نسبت Kcat/Km در آنزیم جهش‌یافته دیده شد.

نتیجه‌گیری: جهش‌های هدفمند اعمال‌شده هیچ اثر منفی روی میزان تولید و همچنین ترشح پروتئین نوترکیب اینورتاز ندارد و باعث افزایش فعالیت آنزیم می‌شود. آنزیم جهش‌یافته نسبت به آنزیم طبیعی، پایداری ساختاری بالاتری دارد، بدون این که تغییری در پایداری عملکردی آن ایجاد کند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Kulshrestha S, Tyagi P, Sindhi V, Yadavilli KS. Invertase and its applications - a brief review. J Pharm Res. 2013;7(9):792-7. [Link] [DOI:10.1016/j.jopr.2013.07.014]
Trimble RB, Maley F. Subunit structure of external invertase from Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 1977;252(12):4409-12. [Link]
Williams RS, Trumbly RJ, MacColl R, Trimble RB, Maley F. Comparative properties of amplified external and internal invertase from the yeast SUC2 gene. J Biol Chem. 1985;260(24):13334-41. [Link]
Pandey A, Webb C, Soccol CR, Larroche C, editors. Enzyme technology. Heidelberg: Springer Science & Business Media; 2006. [Link]
Macauley-Patrick S, Fazenda ML, McNeil B, Harvey LM. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 2005;22(4):249-70. [Link] [DOI:10.1002/yea.1208]
Han X, Liu X, Yin S. P. pastoris expression system. J Microbiol. 2003;4:011. [Link]
Tananchai P, Chisti Y. Stabilization of invertase by molecular engineering. Biotechnol Prog. 2010;26(1):111-7. [Link]
DeRegis CJ, Rahl PB, Hoffman GR, Cerione RA, Collins RN. Mutational analysis of betaCOP (Sec26p) identifies an appendage domain critical for function. BMC Cell Biol. 2008;9:3. [Link] [DOI:10.1186/1471-2121-9-3]
Madden K, Tolstorukov I, Cregg J. Electroporation of Pichia pastoris. In: Van Den Berg MA, Maruthachalam K, editors. Genetic transformation systems in fungi. 1st Volume. New York City: Springer; 2014. pp. 87-91. [Link]
Várnai A, Tang C, Bengtsson O, Atterton A, Mathiesen G, Eijsink VG. Expression of endoglucanases in Pichia pastoris under control of the GAP promoter. Microb Cell Fact. 2014;13(1):57. [Link] [DOI:10.1186/1475-2859-13-57]
Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of ‎protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72(1-2):248-54. [Link] [DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3]
Wray W, Boulikas T, Wray VP, Hancock R. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 1981;118(1):197-203. [Link] [DOI:10.1016/0003-2697(81)90179-2]
Turner P, Mamo G, Karlsson EN. Potential and utilization of thermophiles and thermostable enzymes in biorefining. Microb Cell Fact. 2007;6:9. [Link] [DOI:10.1186/1475-2859-6-9]
Haki GD, Rakshit SK. Developments in industrially important thermostable enzymes: A review. Bioresour Technol. 2003;89(1):17-34. [Link] [DOI:10.1016/S0960-8524(03)00033-6]
Zamost BL, Nielsen HK, Starnes RL. Thermostable enzymes for industrial applications. J Ind Microbiol. 1991;8(2):71-81. [Link] [DOI:10.1007/BF01578757]
Alberto F, Bignon C, Sulzenbacher G, Henrissat B, Czjzek M. The three-dimensional structure of invertase (beta-fructosidase) from Thermotoga maritima reveals a bimodular arrangement and an evolutionary relationship between retaining and inverting glycosidases. J Biol Chem. 2004;279(18):18903-10. [Link] [DOI:10.1074/jbc.M313911200]