مقایسه پایداری ترمودینامیک و بازتاخوردگی سینتیک آنزیم لوسیفراز گونه ایرانی و برخی جهش‌یافته‌های آن

نویسندگان

1 گروه بیوفیزیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران

2 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران

3 گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران

چکیده
اهداف: احتمال برقراری میان‌کنش‌های الکتروستاتیک به‌علت فراوانی رزیدوهای باردار آب‌دوست به‌ویژه آرژنین به‌عنوان مهم‌ترین فاکتور پایدارکننده دمایی آنزیم‌های گرمادوست مطرح شده است. هدف این مطالعه، مقایسه پایداری ترمودینامیک و بازتاخوردگی سینتیک آنزیم لوسیفراز گونه ایرانی و برخی جهش‌یافته‌های آن بود.

مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربی حاضر، پایداری گرمایی و نحوه بازتاخوردگی آنزیم لوسیفراز گونه ایرانی لامفیریس ترکستانیکوس و ۳ جهش‌یافته ERR, ERR/I۲۳۲R, ERR/Q۳۵R/I۱۸۲R/I۲۳۲R توسط تکنیک‌های مختلف اسپکتروسکوپی بررسی شد. ‌به‌منظور بیان بالای پروتئین‌ها یک تک‌‌کلونی ‌از هر یک از نمونه‌ها انتخاب و ‌به ۱۰میلی‌لیتر محیط ‌کشت LB دارای کانامایسین با غلظت ۵۰میکروگرم بر میلی‌گرم تلقیح و در دمای C°‌۳۷ و با هوادهی مطلوب به‌مدت ۱۵-۱۲ ساعت انکوبه شد. ‌به‌منظور تهیه محتوای سلولی از باکتری‌ها، محیط کشت القاشده به‌مدت ۵ دقیقه‌ در ۵۰۰۰گرم و دمای C°‌۴ سانتریفوژ شد. نتایج از طریق مطالعات با روش‌های طیف‌سنجی دورنگ‌نمایی دورانی در ناحیه دور، نزدیک و فلورسانس ذاتی، مطالعات کالریمتری روبشی تفاضلی (DSC) و آزمایش‌های سینتیکی با استفاده از تکنیک جریان متوقف مبتنی بر فلوئورسانس به دست آمد.

یافته‌ها: همراه با افزایش تعداد رزیدوی آرژنین در سطح پروتئین، پایداری و فشردگی ساختاری آنزیم‌های جهش‌یافته در مقایسه با آنزیم وحشی افزایش یافته و ترموگرام‌های حاصل از مطالعات کالریمتری روبشی تفاضلی نیز بیانگر افزایش اندکی در Tm و آنتالپی کالریمتری پروتئین‌های جهش یافته نسبت به پروتئین وحشی بودند.

نتیجه‌گیری: ثابت سرعت بازتاخوردگی آنزیم‌های جهش‌یافته نسبت به نوع وحشی افزایش پیدا کرده است. بهبود پارامترهای ترمودینامیک و سینتیک ناشی از بهبود میان‌کنش‌های الکترواستاتیک است که منجر به درجه بالاتری از فشردگی و تراکم ساختاری می‌شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Xiao L, Honig B. Electrostatic contributions to the stability of hyperthermophilic proteins. J Mol Biol. 1999;289(5):1435-44. [Link] [DOI:10.1006/jmbi.1999.2810]
Kumar S, Tsai CJ, Nussinov R. Factors enhancing protein thermostability. Protein Eng. 2000;13(3):179-91. [Link] [DOI:10.1093/protein/13.3.179]
Kawashima T, Amano N, Koike H, Makino S, Higuchi S, Kawashima-Ohya Y, et al. Archaeal adaptation to higher temperatures revealed by genomic sequence of Thermoplasma volcanium. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97(26):14257-62. [Link] [DOI:10.1073/pnas.97.26.14257]
Kumar S, Nussinov R. Ion pairs and their stabilities fluctuate in NMR the Bacillus caldolyticus cold shock protein. J Mol Biol. 2001;297:975-88. [Link]
Fersht AR. Protein folding and stability: The pathway of folding of barnase. FEBS Lett. 1993;325(1-2):5-16. [Link] [DOI:10.1016/0014-5793(93)81405-O]
Fersht AR. Characterizing transition states in protein folding: An essential step in the puzzle. Curr Opin Struct Biol. 1995;5(1):79-84. [Link] [DOI:10.1016/0959-440X(95)80012-P]
López-Hernéndez E, Serrano L. Structure of the transition state for folding of the 129 aa protein CheY resembles that of a smaller protein, CI-2. Fold Des. 1996;1(1):43-55. [Link] [DOI:10.1016/S1359-0278(96)00011-9]
Mortezavi M, Hosseinkhani S. Design of thermostable luciferases through arginine saturation in solvent-exposed loops. Protein Eng Des Sel. 2011;24(12):893-903. [Link] [DOI:10.1093/protein/gzr051]
Mortazavi M, Hosseinkhani S, Khajeh K, Ranjbar B, Emamzadeh AR. Spectroscopic and functional characterization of Lampyris turkestanicus luciferase: A comparative study. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2008;40(5):365-74. [Link] [DOI:10.1111/j.1745-7270.2008.00411.x]
Ganjalikhany MR, Ranjbar B, Hosseinkhani S, Khalifeh K, Hassani L. Roles of trehalose and magnesium sulfate on structural and functional stability of firefly luciferase. J Mol Catal B Enzym. 2010;62(2):127-32. [Link] [DOI:10.1016/j.molcatb.2009.09.015]
Hosseinkhani S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferas. Cell Mol Life Sci. 2011;68(7):1167-82. [Link] [DOI:10.1007/s00018-010-0607-0]
Tisi LC, White PJ, Squirrell DJ, Murphy MJ, Lowe CR, Murray JAH. Development of a thermostable firefly luciferase. Anal Chim Acta. 2002;457(1):115-23. [Link] [DOI:10.1016/S0003-2670(01)01496-9]
Hirokowa K, Kajiyama N, Murakami S. Improved practical usefulness of firefly luciferase by gene chimerization and random mutagenesis. Biochim Biophys Acta. 2002;1597(2):271-9. [Link] [DOI:10.1016/S0167-4838(02)00302-3]
Law GH, Gandelman OA, Tisi LC, Lowe CR, Murray JA. Mutagenesis of solvent-exposed amino acids in Photinus pyralis luciferase improves thermostability and pH-tolerance. Biochem J. 2006;397(2):305-12. [Link] [DOI:10.1042/BJ20051847]
Khalifeh K, Ranjbar B, Alipour BS, Hosseinkhani S. The effect of surface charge balance on thermodynamic stability and kinetics of refolding of firefly luciferase. BMB Rep. 2011;44(2):102-6. [Link] [DOI:10.5483/BMBRep.2011.44.2.102]
Mehrabi M, Hosseinkhani S, Ghobadi S. Stabilization of firefly luciferase against thermal stress by osmolytes. Int J Biol Macromol. 2008;43(2):187-91. [Link] [DOI:10.1016/j.ijbiomac.2008.05.001]
Arakawa T, Timasheff SN. The stabilization of proteins by osmolytes. Biophys J. 1985;47(3):411-4. [Link] [DOI:10.1016/S0006-3495(85)83932-1]
White PJ, Squirrell DJ, Arnaud P, Lowe CR, Murray JA. Improved thermostability of the North American firefly luciferase: Saturation mutagenesis at position 354. Biochem J. 1996;319(Pt 2):343-50. [Link] [DOI:10.1042/bj3190343]
Said Alipour B, Hosseinkhani S, Ardestani SK, Moradi A. The effective role of positive charge saturation in bioluminescence color and thermostability of firefly luciferase. Photochem Photobiol Sci. 2009;8(6):847-55. [Link] [DOI:10.1039/b901938c]
Maghami P, Ranjbar B, Hosseinkhani S, Ghasemi A, Moradi A, Gill P. Relationship between stability and bioluminescence color of firefly luciferase. Photochem Photobiol Sci. 2010;9(3):376-83. [Link] [DOI:10.1039/b9pp00161a]
Noble JE. Quantification of protein concentration using UV absorbance and Coomassie dyes. Methods Enzymol. 2014;536:17-26. [Link] [DOI:10.1016/B978-0-12-420070-8.00002-7]
Ranjbar B, Gill P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - a review. Chem Biol Drug Des. 2009;74(2):101-20. [Link] [DOI:10.1111/j.1747-0285.2009.00847.x]
Rezaei Tavirani M, Moghaddamnia SH, Ranjbar B, Amani M, Marashi SA. Conformational study of human serum albumin in pre-denaturation temperatures by differential scanning calorimetry, circular dichroism and UV spectroscopy. J Biochem Mol Biol. 2006;39(5):530-6. [Link] [DOI:10.5483/BMBRep.2006.39.5.530]
Khalifeh K, Ranjbar B, Khajeh K, Naderi Manesh H, Sadeghi M, Gharavi S. A stopped-flow fluorescence study of the native and modified lysozyme. Biologia. 2007;62(3):258-64. [Link] [DOI:10.2478/s11756-007-0045-0]
Gill P, Tohidi Moghadam T, Ranjbar B. Differential scanning calorimetry techniques: Applications in biology and nanoscience. J Biomol Tech. 2010;21(4):167-93. [Link]
Arnold K, Bordoli L, Kopp J, Schwede T. The SWISS-MODEL workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 2006;22(2):195-201. [Link] [DOI:10.1093/bioinformatics/bti770]
DeLuca M, McElroy WD. Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. Biochemistry. 1974;13(5):921-5. [Link] [DOI:10.1021/bi00702a015]
Zhou XX, Wang YB, Pan YJ, Li WF. Differences in amino acids composition and coupling patterns between mesophilic and thermophilic proteins. Amino Acids. 2008;34(1):25-33. [Link] [DOI:10.1007/s00726-007-0589-x]
Chakravarty S, Varadarajan R. Elucidation of determinants of protein stability through genome sequence analysis. FEBS Lett. 2000;470(1):65-9. [Link] [DOI:10.1016/S0014-5793(00)01267-9]
Pace CN, Alston RW, Shaw KL. Charge-charge interactions influence the denatured state ensemble and contribute to protein stability. Protein Sci. 2000;9(7):1395-8. [Link] [DOI:10.1110/ps.9.7.1395]
Protasevich I, Ranjbar B, Lobachov V, Makarov A, Gilli R, Briand C, et al. Conformation and thermal denaturation of apocalmodulin: Role of electrostatic mutations. Biochemistry. 1997;36(8):2017-24. [Link] [DOI:10.1021/bi962538g]