شناسایی مولکولی و بهینه‌سازی تولید آنزیم پروتئاز قلیایی خارج سلولی باکتری باسیلوس پسودوفیرموس MSB22 با استفاده از روش‌شناسی سطح پاسخ

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

2 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه گنبد کاووس، گلستان، ایران

چکیده
اهداف: پروتئازهای قلیایی یکی از مهم‌ترین گروه از آنزیم‌های صنعتی هستند و کاربردهای فراوانی دارند. هدف مطالعه حاضر یافتن پارامترهای فیزیکوشیمیایی موثر بر تولید آنزیم پروتئاز قلیایی تولیدشده توسط باکتری باسیلوس پسودوفیرموس MSB۲۲ به‌وسیله روش تک‌عاملی (OFAT) و سپس بهینه‌سازی تولید این آنزیم با روش سطح پاسخ در قالب طرح مرکب مرکزی چرخش‌پذیر بود.

مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربی حاضر جداسازی میکروارگانیزم تولیدکننده پروتئاز قلیایی از نمونه‌های پساب کارخانه‌های سوسیس و کالباس اصفهان انجام شد. خصوصیات موفولوژیکی و بیوشیمیایی سویه طبق کتاب برگی و به‌وسیله تکثیر توالی ژن ۱۶S rRNA صورت پذیرفت. تشخیص ژن متالوپروتئاز و سرین‌پروتئاز قلیایی با واکنش واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) و سنجش فعالیت آنزیم با معرف فولین انجام شد. غربالگری متغیرهای موثر در تولید آنزیم با روش تک‌عاملی و بهینه‌سازی تولید با روش سطح پاسخ و بررسی آماری صورت گرفت. نرم‌افزار MEGA ۶ برای آنالیزهای فیلوژنتیکی به کار رفت. به‌منظور تحلیل داده‌ها نرم‌افزار Design Expert ۷ و آزمون تحلیل واریانس یک‌طرفه به کار رفتند.

یافته‌ها: حداکثر تولید پروتئاز که به‌ترتیب ۸۵/۱برابر و ۳/۴۵ برابر بیشتر از مقدار تولیدشده حاصل بهینه‌سازی روش تک‌عاملی و شرایط غیربهینه بود، با استفاده از ۱% قند زایلوز، ۳% عصاره گوشت، ۴% مایه تلقیح باکتریایی، در pH برابر ۱۰ و دمای ۳۰درجه سانتی گراد به دست آمد. مدل درجه دوم به‌دلیل بالابودن مقدار ضریب تشخیص پیش‌بینی، توانایی زیادی در پیش‌بینی داده‌های جدید داشت.

نتیجه‌گیری: روش تک‌عاملی و سطح پاسخ به‌ترتیب در غربالگری متغیرهای موثر و بهینه‌سازی تولید آنزیم مفید هستند و ژن‌های sub I و sub II (ژن‌های سرین‌پروتئازهای قلیایی) در باسیلوس پسودوفیرموس MSB۲۲ وجود دارند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Rai SK, Roy JK, Mukherjee AK. Characterisation of a detergent-stable alkaline protease from a novel thermophilic strain Paenibacillus tezpurensis sp. nov. AS-S24-II. Appl microbiol biotechnol. 2010;85(5):1437-50. [Link] [DOI:10.1007/s00253-009-2145-y]
Jisha VN, Smitha RB, Pradeep S, Sreevedi S, Unni KN, Sajith S, et al. Versatility of microbial proteases. Adv Enzym Res. 2013;1(3):39-51. [Link] [DOI:10.4236/aer.2013.13005]
Ferracini-Santos L, H Sato H. Production of alkaline protease from Cellulosimicrobium cellulans. Braz J Microbiol. 2009;40(1):54-60. [Link] [DOI:10.1590/S1517-83822009000100008]
Anbu P, Annadurai G, Hur BK. Production of alkaline protease from a newly isolated Exiguobacterium profundum BK-P23 evaluated using the response surface methodology. Biologia. 2013;68(2):186-93. [Link] [DOI:10.2478/s11756-013-0159-5]
Singh SK, Singh SK, Tripathi VR, Khare SK, Garg SK. Comparative one-factor-at-a-time, response surface (statistical) and bench-scale bioreactor level optimization of thermoalkaline protease production from a psychrotrophic Pseudomonas putida SKG-1 isolate. Microb Cell Fact. 2011;10:114. [Link] [DOI:10.1186/1475-2859-10-114]
Vaishnav D, Suthar J, Oza T, Dave G, Sheth N. A statistical approach for the enhanced production of thermostable alkaline protease showing detergent compatibility activity from Bacillus circulans. Biocatal Biotransform. 2014;32(3):151-60. [Link] [DOI:10.3109/10242422.2014.913579]
Bach HJ, Hartmann A, Schloter M, Munch JC. PCR primers and functional probes for amplification and detection of bacterial genes for extracellular peptidases in single strains and in soil. J Microbiol Methods. 2001;44(2):173-82. [Link] [DOI:10.1016/S0167-7012(00)00239-6]
Cupp-Enyard C. Sigma's non-specific protease activity assay-casein as a substrate. J Vis Exp. 2008;(19):e899. [Link] [DOI:10.3791/899]
Gupta R, Beg QK, Khan S, Chauhan B. An overview on fermentation, downstream processing and properties of microbial alkaline proteases. Appl Microbiol Biotechnol. 2000;60(4):381-95. [Link]
Bhunia B, Basak B, Dey A. A review on production of serine alkaline protease by Bacillus spp. J Biochem Technol. 2012;3(4):448-57. [https://www.researchgate.net/publication/237006217]
Chi Z, Ma C, Wang P, Li HF. Optimization of medium and cultivation conditions for alkaline protease production by the marine yeast Aureobasidium pullulans. Bioresour Technol. 2007;98(3):534-8. [Link] [DOI:10.1016/j.biortech.2006.02.006]
Patel R, Dodia M, Singh SP. Extracellular alkaline protease from a newly isolated haloalkaliphilic Bacillus sp.: Production and optimization. Process Biochem. 2005;40(11):3569-75. [Link] [DOI:10.1016/j.procbio.2005.03.049]
Naidu K.S.B., Devi K.L. Optimization of thermostable alkaline protease production from species of Bacillus using rice bran. Afr J Biotechnol. 2005;4(7):724-6. [Link] [DOI:10.5897/AJB2005.000-3132]
Sen Sh, Dasu Veeranki V, Mandal B. Effect of physical parameters, carbon and nitrogen sources on the production of alkaline protease from a newly isolated Bacillus pseudofirmus SVB1. Ann Microbiol. 2009;59(3):531-8. [Link] [DOI:10.1007/BF03175142]
Shafee N, Norarati Aris S, Abd Rahman RNZ, Basir M, Salleh AB. Optimization of environmental and nutritional conditions for the production of alkaline protease by a newly isolated bacterium Bacillus cereus strain 146. J Appl Sci Res. 2005;1(1):1-8. [Link]
Patel RK, Dodia MS, Joshi RH, Singh SP. Production of extracellular halo-alkaline protease from a newly isolated haloalkaliphilic Bacillus sp. isolated from seawater in Western India. World J Microbiol Biotechnol. 2006;22(4):375-82. [Link] [DOI:10.1007/s11274-005-9044-x]