بیان موقت فرم نوترکیب آنزیم اندونوکلئاز PARS II با روش آگرواینفیلتراسیون در گیاه توتون

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی و به‌نژادی گیاهان زراعی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران

2 گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

چکیده
اهداف: تولید پروتئین‌های نوترکیب در گیاهان تراریخته (زراعت مولکولی)، یکی از جنبه‌های کاربردی مهندسی ژنتیک محسوب می‌شود. پروتئین‌های تولیدشده توسط گیاهان بر خلاف سیستم‌های تولید مبتنی بر سلول‌های جانوری و باکتریایی به‌علت عدم وجود عوامل بیماری‌زای مشترک انسان و دام، بسیار ایمن هستند و هزینه‌ تولید پایینی دارند. هدف این پژوهش، بیان موقت فرم نوترکیب آنزیم اندونوکلئاز PARS II با استفاده از روش آگرواینفیلتراسیون در گیاه توتون بود.

مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربی حاضر، امکان تولید فرم نوترکیب اندونوکلئاز PARS II با استفاده از سیستم بیان موقت به‌واسطه آگروباکتریوم مورد بررسی قرار گرفت. سازه بیانی pBI-Pars (مبتنی بر ناقل دوگانه pBI۱۲۱) حاوی توالی کامل رمزکننده PARS II، توالی کوتاه کوزاک در بالادست و توالی رمزکننده هشت آمینواسید هیستیدین در پایین‌دست ژن، ساخته و با روش آگرواینفلتراسیون به برگ‌های توتون (Nicotiana tabacum) تزریق شد. پس از گذشت ۷۲ ساعت، بیان ژن مورد نظر در نمونه‌های آگرواینفیلتره‌شده با واکنش RT-PCR و بلات نقطه‌ای با آنتی‌بادی ضدهیستیدین به‌ترتیب در سطح mRNA و پروتئین انجام شد.

یافته‌ها: صحت سازه بیانی ساخته‌شده تایید شد و نتایج بلات نقطه‌ای با آنتی‌‌بادی ضدهیستیدین، بیان پروتئین نوترکیب PARS II را مورد تایید قرار داد، در حالی که هیچ نشانی از بیان پروتئین نوترکیب در گیاهان شاهد آگرواینفیلتره‌شده با سازه pBI۱۲۱ مشاهده نشد. مقادیر قابل توجهی از نوکلئاز نوترکیب PARS II در برگ‌های توتون تولید شد.

نتیجه‌گیری: روش آگرواینفیلتراسیون یک روش موثر و کوتاه‌مدت برای تولید انبوه نوکلئاز خالص نوترکیب PARS II در گیاه توتون است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Tsuji T, Niida Y. Development of a simple and highly sensitive mutation screening system by enzyme mismatch cleavage with optimized conditions for standard laboratories. Electrophoresis. 2008;29(7):1473-83. [Link] [DOI:10.1002/elps.200700729]
Yeung AT, Hattangadi D, Blakesley L, Nicolas E. Enzymatic mutation detection technologies. Biotechniques. 2005;38(5):749-58. [Link] [DOI:10.2144/05385RV01]
Vogiatzakis N, Kekou K, Sophocleous C, Kitsiou S, Mavrou A, Bakoula C, et al. Screening human genes for small alterations performing an enzymatic cleavage mismatched analysis (ECMA) protocol. Mol Biotechnol. 2013;55(1):1-9. [Link] [DOI:10.1007/s12033-007-0062-9]
Shi Y, Terry SF, Terry PF, Bercovitch LG, Gerard GF. Development of a rapid, reliable genetic test for pseudoxanthoma elasticum. J Mol Diagn. 2007;9(1):105-12. [Link] [DOI:10.2353/jmoldx.2007.060093]
Wang GX, Tan MK, Rakshit S, Saitoh H, Terauchi R, Imaizumi T, et al. Discovery of single-nucleotide mutations in acetolactate synthase genes by Ecotilling. Pestic Biochem Physiol. 2007;88(2):143-8. [Link] [DOI:10.1016/j.pestbp.2006.10.006]
Nieto C, Piron F, Dalmais M, Marco CF, Moriones E, Gómez-Guillamón ML, et al. EcoTILLING for the identification of allelic variants of melon eIF4E, a factor that controls virus susceptibility. BMC Plant Biol. 2007;7:34. [Link] [DOI:10.1186/1471-2229-7-34]
Brady SM, Provart NJ. Extreme breeding: Leveraging genomics for crop improvement. J Sci Food Agric. 2007;87(6):925-9. [Link] [DOI:10.1002/jsfa.2763]
Sokurenko EV, Tchesnokova V, Yeung AT, Oleykowski CA, Trintchina E, Hughes KT, et al. Detection of simple mutations and polymorphisms in large genomic regions. Nucleic Acids Res. 2001;29(22):e111. [Link] [DOI:10.1093/nar/29.22.e111]
Comai L, Young K, Till BJ, Reynolds SH, Greene EA, Codomo CA, et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. Plant J. 2004;37(5):778-86. [Link] [DOI:10.1111/j.0960-7412.2003.01999.x]
Comai L, Henikoff S. TILLING: Practical single‐nucleotide mutation discovery. Plant J. 2006;45(4):684-94. [Link] [DOI:10.1111/j.1365-313X.2006.02670.x]
Holkers M, Maggio I, Liu J, Janssen JM, Miselli F, Mussolino C, et al. Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and lentiviral vector gene transfer into human cells. Nucleic Acids Res. 2013;41(5):e63. [Link] [DOI:10.1093/nar/gks1446]
Maier DA, Brennan AL, Jiang S, Binder-Scholl GK, Lee G, Plesa G, et al. Efficient clinical scale gene modification via zinc finger nuclease-targeted disruption of the HIV co-receptor CCR5. Hum Gene Ther. 2013;24(3):245-58. [Link] [DOI:10.1089/hum.2012.172]
Desai NA, Shankar V. Single-strand-specific nucleases. FEMS Microbiol Rev. 2003;26(5):457-91. [Link] [DOI:10.1111/j.1574-6976.2003.tb00626.x]
Mon H, Lee J, Fukushima M, Nagata Y, Fujii M, Xu J, et al. Production and characterization of the celery mismatch endonuclease CEL II using baculovirus/silkworm expression system. Appl Microbiol Biotechnol. 2013;97(15):6813-22. [Link] [DOI:10.1007/s00253-012-4583-1]
Oleykowski CA, Mullins CRB, Godwin AK, Yeung AT. Mutation detection using a novel plant endonuclease. Nucleic Acids Res. 1998;26(20):4597-602. [Link] [DOI:10.1093/nar/26.20.4597]
Triques K, Sturbois B, Gallais S, Dalmais M, Chauvin S, Clepet C, et al. Characterization of Arabidopsis thaliana mismatch specific endonucleases: Application to mutation discovery by TILLING in pea. Plant J. 2007;51(6):1116-25. [Link] [DOI:10.1111/j.1365-313X.2007.03201.x]
Zolala J, Bahrami AR, Farsi M, Matin MM, Yassaee VR. Comparison of CEL I gene expression and mismatch-cleavage activity in some Apiaceae plants. Mol Breed. 2009;24(1):17-24. [Link] [DOI:10.1007/s11032-009-9267-x]
Mirzaei M, Zolala J, Shalouzad A. Isolation, cloning and molecular characterization of genes encoding single-strand specific endonucleases from Parsley (Petroselinum crispum L.). J Agric Biotechnol. 2015;7(1):201-15. [Persian] [Link]
Huang FC, Studart-Witkowski C, Schwab W. Overexpression of hydroperoxide lyase gene in Nicotiana benthamiana using a viral vector system. Plant Biotechnol J. 2010;8(7):783-95. [Link] [DOI:10.1111/j.1467-7652.2010.00508.x]
Kapila J, De Rycke R, Van Montagu M, Angenon G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. 1997;122(1):101-8. [Link] [DOI:10.1016/S0168-9452(96)04541-4]
Sainsbury F, Thuenemann EC, Lomonossoff GP. pEAQ: Versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnol J. 2009;7(7):682-93. [Link] [DOI:10.1111/j.1467-7652.2009.00434.x]
Wydro M, Kozubek E, Lehmann P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochim Pol. 2006;53(2):289-98. [Link]
Yang B, Wen X, Kodali NS, Oleykowski CA, Miller CG, Kulinski J, et al. Purification, cloning, and characterization of the CEL I nuclease. Biochemistry. 2000;39(13):3533-41. [Link] [DOI:10.1021/bi992376z]
Kozak M. The scanning model for translation: An update. J Cell Biol. 1989;108(2):229-41. [Link] [DOI:10.1083/jcb.108.2.229]
Sambrook J, Green MR. Appendix 1, Reagents and buffers. Molecular cloning: A laboratory manual. [Link]
Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72(1-2):248-54. [Link] [DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3]
Baron U, Imhoff U, Koch J, Leuer M, Weber J, Olek K, inventors; Biopsytec Analytik Gmbh, assignee. Mutated nucleic acid of a CEL I-endonuclease and method for producing the recombinant, full-length CEL I-protein. WO2004035771. 2003 Oct 9. [Link]
Pimkin M, Caretti E, Canutescu A, Yeung JB, Cohn H, Chen Y, et al. Recombinant nucleases CEL I from celery and SP I from spinach for mutation detection. BMC Biotechnol. 2007;7:29. [Link] [DOI:10.1186/1472-6750-7-29]
Bendahmane A, Sturbois B, Triques K, Caboche M, inventors; Genoplante-Valor, Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), assignees. Method for producing highly sensitive endonucleases, novel preparations of endonucleases and uses thereof. US20120009583A1. 2004 Jul 30. [Link]