محلول‌سازی و تخلیص بهینه پروتئین نوترکیب امتزاجی تری‌پاراتید بیان‌شده در اشریشیا کلی

نویسندگان

پژوهشکده زیست‌فناوری، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران

چکیده
اهداف: روش‌های تخریب سلولی مختلفی برای استخراج پروتئین‌های داخل سیتوپلاسمی وجود دارد. هدف مطالعه حاضر انتخاب بهترین روش استخراج پروتئین امتزاجی نوترکیب تری‌پاراتید از میزبان باکتریایی اشریشیا کلی و دستیابی به بهترین شرایط تخلیص آن بود.

مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربی حاضر، سلول‌های باکتری با روش‌های سونیکاسیون با دورهای متفاوت، له‌کردن در نیتروژن مایع، هموژناسیون تحت دو فشار مختلف و روش شیمیایی شکسته شدند. نمونه‌های مربوط به رسوب و محلول رویی حاصل از هر روش، در ژل سدیم‌دودسیل‌سولفات الکتروفورز شدند. سلول‌های شکسته‌شده در محیط کشت لوریا برتانی جامد کشت و به‌روش گرم رنگ‌آمیزی شدند. کروماتوگرافی تمایلی نیکل برای خالص‌سازی پروتئین در شرایط واسرشته و غیرواسرشته به‌ترتیب با شیب pH و غلظت ایمیدازول به کار رفت. تمامی نمونه‌ها روی ژل سدیم‌دودسیل‌سولفات- پلی‌اکریل‌آمید برده شدند و محاسبه میزان پروتئین تخلیص‌شده با آزمون میکروبرادفورد صورت گرفت.

یافته‌ها: در دورهای ۲۰ و ۲۵دور در دقیقه بخش زیادی از پروتئین امتزاجی وارد بخش محلول شد. در روش له‌کردن در نیتروژن مایع، پروتئین‌ها بیشتر وارد بخش رسوب شدند. تخریب سلول‌ها در روش شیمیایی کامل بود. شکستن سلول‌ها با هموژناسیون تحت فشار ۵۰بار، بیشتر از ۱۵بار بود. در تخریب شیمیایی همراه با سونیکاسیون مقدار بسیار زیادی از پروتئین امتزاجی وارد بخش محلول شد. در شرایط غیرواسرشته هیچ پروتئین امتزاجی نوترکیبی با بافر جداسازی از ستون خارج نشد، اما در شرایط واسرشته مقدار زیادی از پروتئین تخلیص شد.

نتیجه‌گیری: در تخریب شیمیایی همراه با سونیکاسیون، ۷/۹۷% پروتئین کل به بخش محلول وارد می‌شود و تخلیص در شرایط واسرشته برخلاف شرایط غیرواسرشته به‌طور مناسب و مطلوب صورت می‌گیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Harrison ST. Bacterial cell disruption: A key unit operation in the recovery of intracellular products. Biotechnol Adv. 1991;9(2):217-40. [Link] [DOI:10.1016/0734-9750(91)90005-G]
Sattayasai N. Protein purification. In: Ekinci D, editor. Chemical biology. London: IntechOpen; 2012. p. 444. [Link] [DOI:10.5772/35425]
Peternel Š. Bacterial cell disruption: A crucial step in protein production. N Biotechnol. 2013;30(2):250-4. [Link] [DOI:10.1016/j.nbt.2011.09.005]
Peternel Š, Bele M, Gaberc-Porekar V, Menart V. Nonclassical inclusion bodies in Escherichia coli. Microb Cell Factories. 2006;5(Suppl 1):P23.
https://doi.org/10.1186/1475-2859-5-23
https://doi.org/10.1186/1475-2859-5-S1-S23 [Link] [DOI:10.1186/1475-2859-5-S1-P23]
Magdeldin S, Moser A. Affinity chromatography: Principles and applications. In: Magdeldin S, editor. Affinity chromatography. London: IntechOpen; 2012. p. 368.
https://doi.org/10.5772/1959 [Link] [DOI:10.5772/39087]
Yip TT, William Hutchens T. Metal ion affinity adsorption of a Zn (II)-transport protein present in maternal plasma during lactation: Structural characterization and identification as histidine-rich glycoprotein. Protein Expr Purif. 1991;2(5-6):355-62. [Link] [DOI:10.1016/1046-5928(91)90094-Y]
Porath J, Olin B. Immobilized metal ion affinity adsorption and immobilized metal ion affinity chromatography of biomaterials, serum protein affinities for gel-immobilized iron and nickel ions. Biochemistry. 1983;22(7):1621-30. [Link] [DOI:10.1021/bi00276a015]
Bornhorst JA, Falke JJ. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 2000;326:245-54. [Link] [DOI:10.1016/S0076-6879(00)26058-8]
Bakhtiari N, Amini Bayat Z, Sagharidouz S, Vaez M. Overexpression of recombinant human teriparatide, rhP TH (1-34) in Escherichia coli: An innovative gene fusion approach. Avicenna J Med Biotechnol. 2017;9(1):19-22. [Link]
Amini Bayat Z, Shame Riz Sh. Soluble protein production methods. 1st Volume. Tehran: Iideh Negar; 2015. [Persian] [Link]
Tsumoto K, Ejima D, Kumagai I, Arakawa T. Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies. Protein Expr Purif. 2003;28(1):1-8. [Link] [DOI:10.1016/S1046-5928(02)00641-1]
Loughran ST, Bree RT, Walls D. Purification of polyhistidine-tagged proteins. In: Walls D, Loughran S, editors. Protein chromatography, methods in molecular biology. 1485th Volume. New York: Humana Press; 2017. pp. 275-303. [Link] [DOI:10.1007/978-1-4939-6412-3_14]