بهینه سازی تولید پروتئین نوترکیب β-NGF در بیوراکتور

نویسندگان

گروه مهندسی علوم زیستی، دانشکده علوم و فنون نوین، دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده
اهداف: فاکتور رشد عصبی β–NGF یک عامل درمانی مهم در درمان بسیاری از بیماری‌های تحلیل عصبی مثل آلزایمر است، لذا تولید نوترکیب آن در مقیاس انبوه از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. هدف از بررسی حاضر بهینه‌سازی فاکتورهای موثر در دست‌یابی به بیشترین میزان تولید پروتئین β–NGF در فرمانتور است.

مواد و روش‌ها: از آنجا که باکتری E. coli سویه بیانی مناسبی برای تولید در مقیاس صنعتی است، در مطالعه حاضر از سویه DE۳ باکتری E. coli به‌منظور تولید پروتئین نوترکیب β–NGF استفاده شد. همچنین از بیوراکتور ۵لیتری به‌منظور تولید پروتئین استفاده شد و میزان اکسیژن محلول (DO%) و دمای پس از القا با استفاده از روش نرم‌افزار آماری سطح پاسخ (RSM) بهینه‌سازی شد. ابتدا تاثیر این دو متغیر بر میزان تولید پروتئین مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور در هر آزمایش کل محتوای پروتئینی استخراج و با روش برادفورد تعیین غلظت شد.

یافته‌ها: نتایج نشان داد که بهینه شرایط برای دست‌یابی به بیشترین میزان تولید پروتئین دمای پس از القای ºC۵/۲۸ و DO، ۳۰% است و در این شرایط غلظت پروتئین تولیدی ۶۱/۰±۶/۹میکروگرم بر میلی‌لیتر است. نهایتاً تاثیر این فاکتورها بر تولید پروتئین β–NGF با استفاده از روش دات‌بلات مورد ارزیابی قرار گرفت که نتایج نشان‌دهنده بیشترین میزان تولید در شرایط بهینه‌سازی‌شده است.

نتیجه‌گیری: به‌طور کلی می‌توان چنین نتیجه‌گیری کرد که میزان DO% و دمای پس از القا علاوه بر تاثیر بر رشد باکتری نوترکیب E. coli در بیوراکتور، بر میزان تولید و بیان پروتئین های نوترکیب (مثل β–NGF) نیز تاثیر مستقیمی دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Wiesmann C, Ultsch MH, Bass SH, De Vos AM. Crystal structure of nerve growth factor in complex with the ligand-binding domain of the TrkA receptor. Nature. 1999;401(6749):184-8. [Link] [DOI:10.1038/43705]
Wiesmann C, De Vos AM. Nerve growth factor: Structure and function. Cell Mol Life Sci CMLS. 2001;58(5-6):748-59. [Link] [DOI:10.1007/PL00000898]
Snider WD. Functions of the neurotrophins during nervous system development: What the knockouts are teaching us. Cell. 1994;77(5):627-38. [Link] [DOI:10.1016/0092-8674(94)90048-5]
Heese K, Low JW, Inoue N. Nerve growth factor, neural stem cells and Alzheimer's disease. Neurosignals. 2006;15(1):1-2. [Link] [DOI:10.1159/000094383]
Mobley WC, Schenker A, Shooter EM. Characterization and isolation of proteolytically modified nerve growth factor. Biochemistry. 1976;15(25):5543-52. [Link] [DOI:10.1021/bi00670a019]
Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Front Microbiol. 2014;5:172. [Link] [DOI:10.3389/fmicb.2014.00172]
Schumann W, Ferreira LC. Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Genet Mol Biol. 2004;27(3):442-53. [Link] [DOI:10.1590/S1415-47572004000300022]
Saez NJ, Vincentelli R. High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. Methods Mol Biol. 2014;1091:33-53. [Link] [DOI:10.1007/978-1-62703-691-7_3]
Wang D, Wang Ch, Wu H, Li Z, Ye Q. Glutathione production by recombinant Escherichia coli expressing bifunctional glutathione synthetase. J Ind Microbiol Biotechnol. 2016;43(1):45-53. [Link] [DOI:10.1007/s10295-015-1707-5]
Lee EJ, Lee BH, Kim BK, Lee JW. Enhanced production of carboxymethylcellulase of a marine microorganism, Bacillus subtilis subsp. subtilis A-53 in a pilot-scaled bioreactor by a recombinant Escherichia coli JM109/A-53 from rice bran. Mol Biol Rep. 2013;40(5):3609-21. [Link] [DOI:10.1007/s11033-012-2435-9]
Zaslona H, Trusek‐Holownia A, Radosinski L, Hennig J. Optimization and kinetic characterization of recombinant 1, 3‐β‐glucanase production in Escherichia coli K‐12 strain BL21/pETSD10-a bioreactor scale study. Lett Appl Microbiol. 2015;61(1):36-43. [Link] [DOI:10.1111/lam.12419]
Kahraman M, Ordu EB, Yeşiladalı K, Karagüler NG, Tamerler C. Improved Candida methylica formate dehydrogenase fermentation through statistical optimization of low-cost culture media. Prep Biochem Biotechnol. 2012;42(6):507-19. [Link] [DOI:10.1080/10826068.2012.659102]
Myers RH, Montgomery DC, Anderson-cook CM. Response surface methodology: Process and product optimization using designed experiments. 4th Edition. New York: Wiley; 2016. [Link]
Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd Edition. 1st Volume. New York: Cold Spring-Harbour Laboratory Press; 2001. [Link]
Banerjee A, Dubey S, Kaul P, Barse B, Piotrowski M, Banerjee UC. Enantioselective nitrilase from Pseudomonas putida: Cloning, heterologous expression, and bioreactor studies. Mol Biotechnol. 2009;41(1):35-41. [Link] [DOI:10.1007/s12033-008-9094-z]
Hajihassan Z, Sohrabi M, Rajabi Bazl M, Eftekhary H. Expression of human nerve growth factor beta and bacterial protein disulfide isomerase (DsbA) as a fusion protein (DsbA:: hNGF) significantly enhances periplasmic production of hNGF beta in Escherichia coli. Rom Biotechnol Lett. 2016;21(5):11850-6. [Link]
Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72(1-2):248-54. [Link] [DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3]
Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 2012;9(7):671-75. [Link] [DOI:10.1038/nmeth.2089]
Sahdev S, Khattar SK, Saini KS. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: A review of the existing biotechnology strategies. Mol Cell Biochem. 2008;307(1-2):249-64. [Link] [DOI:10.1007/s11010-007-9603-6]
Savari M, Zarkesh Esfahani SH, Edalati M, Biria D. Optimizing conditions for production of high levels of soluble recombinant human growth hormone using Taguchi method. Protein Expr Purif. 2015;114:128-35. [Link] [DOI:10.1016/j.pep.2015.06.006]
Azaman SNA, Ramakrishnan NR, Tan JS, Rahim RA, Abdullah MP, Ariff AB. Optimization of an induction strategy for improving interferon‐α2b production in the periplasm of Escherichia coli using response surface methodology. Biotechnol Appl Biochem. 2010;56(4):141-50. [Link] [DOI:https://doi.org/10.1042/BA20100104]
Gholami Tilko P, Hajihassan Z, Moghimi H. Optimization of recombinant β-NGF expression in Escherichia coli using response surface methodology. Prep Biochem Biotechnol. 2017;47(4):406-13. [Link] [DOI:10.1080/10826068.2016.1252927]
Gholami tilko P, Hajihassan Z, Nazari N, Moghimi H. Optimization of the effective factors in E.coli growth producing recombinant β-NGF using response surface methodology. Modares J Biotechnol. 2017;8(3):53-63. [Persian] [Link]
Papaneophytou CP, Kontopidis GA. Optimization of TNF-α overexpression in Escherichia coli using response surface methodology: Purification of the protein and oligomerization studies. Protein Expr Purif. 2012;86(1):35-44. [Link] [DOI:10.1016/j.pep.2012.09.002]
Pranchevicius MCS, Oliveira LL, Rosa JC, Avanci NC, Quiapim AC, Roque-Barreira MC, et al. Characterization and optimization of ArtinM lectin expression in Escherichia coli. BMC Biotechnol. 2012;12:44. [Link] [DOI:10.1186/1472-6750-12-44]