بیان ترشحی کلسیتونین نوترکیب انسانی در ریزجلبک سبز کلامیدوموناس رینهاردتی

نویسندگان

پژوهشکده زیست‌فناوری، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران

چکیده
کلسیتونین هورمون پپتیدی کوچکی است که در انسان توسط سلول‌های پارافولیکولار تیروئید تولید شده و تنظیم‌کننده متابولیسم کلسیم و فسفر است. کاربرد دارویی کلسیتونین در درمان ناهنجاری‌های مربوط به کلسیم و پوکی استخوان است. به‌علت وزن مولکولی پایین و ناپایداری آن، تولید نوترکیب کلسیتونین با مشکلات زیادی همراه بوده و همچنین تولید در سیستم پروکاریوتی به تیمارهای بعدی برای دستیابی به مولکول بالغ نیاز دارد. اخیراً به توانایی ریزجلبک‌ها در بیان پروتئین‌های نوترکیب توجه زیادی جلب شده است. لذا هدف این تحقیق، مطالعه توانایی Chlamydomonas Reinhardtii در تولید ترشحی کلسیتونین انسانی نوترکیب بود.

مواد و روش‌ها: توالی کدکننده کلسیتونین بهینه‌سازی‌شده به‌همراه توالی راهبر ترشحی کربونیک‌انیدراز در وکتورهای Pchlamy_۳ وPchlamy_۴ کلون شد. پلاسمیدهای نوترکیب به سویه وحشی و سویه واجد دیواره ناقص Chlamydomonas Reinhardtii با روش الکتروپوریشن منتقل شدند. سویه‌های نوترکیب با روش کلنی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز غربالگری شده و سویه‌های منتخب برای تولید کلسیتونین کشت داده شدند. پس از رشد سویه‌ها، محیط کشت جمع‌آوری شده و با روش الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت.

یافته‌ها: وکتور Pchlamy_۳ از قابلیت مناسبی برای بیان توالی هدف برخوردار نبوده و سویه‌های نوترکیب همگی با استفاده از وکتور Pchlamy_۴ حاصل شدند. همچنین سویه وحشی نیز کارآیی مناسبی جهت نوترکیبی نداشته و نوترکیبی فقط در سویه واجد دیواره ناقص دیده شد. میزان کلسیتونین تولیدی در سویه مثبت به‌صورت تقریبی یک پیکوگرم بر میلی‌لیتر محاسبه شد.

نتیجه‌گیری: نتایج این مطالعه نشان می‌دهند که راهبرد به‌کاررفته برای تولید ترشحی کلسیتونین نوترکیب موفقیت‌آمیز بوده و برای مطالعات بعدی قابل استفاده است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Ofoghi H, Moazami N, Domonsky NN, Ivanov I. Cloning and expression of human calcitonin genes in transgenic potato plants. Biotechnol Lett. 2000;22(7):611-5. [Link] [DOI:10.1023/A:1005629718949]
Azria M. Calcitonins - physiological and pharmacological aspects. In: Azria M, editor. Calcitonins - physiological and pharmacological aspects, Mafosfamide - a derivative of 4-Hydroxycyclophosphamide. Enzymatic DNA methylation. Berlin/Heidelberg: Springer-Verlag; 1989. pp. 1-34.
_1 [Link] [DOI:10.1007/978-3-642-74734-2]
Zaidi M, Breimer LH, MacIntyre I. Biology of peptides from the calcitonin genes. Q J Exp Physiol. 1987;72(4):371-408. [Link] [DOI:10.1113/expphysiol.1987.sp003084]
Zaidi M, Inzerillo AM, Moonga BS, Bevis PJ, Huang CL. Forty years of calcitonin--where are we now? a tribute to the work of Iain Macintyre, FRS. Bone. 2002;30(5):655-63. [Link] [DOI:10.1016/S8756-3282(02)00688-9]
Ivanov I, Tam J, Wishart P, Jay E. Chemical synthesis and expression of the human calcitonin gene. Gene. 1987;59(2-3):223-30. [Link] [DOI:10.1016/0378-1119(87)90330-1]
Salehzadeh A, Ofoghi H, Roohvand F, Aghasadeghi MR, Parivar K. Human calcitonin (hCT) gene expression and secretion by Pichia pastoris. Rom Biotechnol Lett. 2012;17(1):7036-42. [Link]
León-Ba-ares R, González-Ballester D, Galván A, Fernández E. Transgenic microalgae as green cell-factories. Trends Biotechnol. 2004;22(1):45-52. [Link] [DOI:10.1016/j.tibtech.2003.11.003]
Rasala BA, Mayfield SP. The microalga Chlamydomonas reinhardtii as a platform for the production of human protein therapeutics. Bioeng Bugs. 2011;2(1):50-4. [Link] [DOI:10.4161/bbug.2.1.13423]
Walker TL. The development of microalgae as a bioreactor system for the production of recombinant proteins [Dissertation]. Brisbane: Queensland University of Technology; 2004. [Link]
Rosales-Mendoza S, Paz-Maldonado LM, Soria-Guerra RE. Chlamydomonas reinhardtii as a viable platform for the production of recombinant proteins: Current status and perspectives. Plant Cell Rep. 2012;31(3):479-94. [Link] [DOI:10.1007/s00299-011-1186-8]
Harris EH, Stern DB, Witman GB. The Chlamydomonas sourcebook. 1st Volmme. Cambridge: Cambridge University Press; 2009. [Link]
Lauersen KJ, Berger H, Mussgnug JH, Kruse O. Efficient recombinant protein production and secretion from nuclear transgenes in Chlamydomonas reinhardtii. J Biotechnol. 2013;167(2):101-10. [Link] [DOI:10.1016/j.jbiotec.2012.10.010]
Mason HS, Lam DM, Arntzen CJ. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(24):11745-9. [Link] [DOI:10.1073/pnas.89.24.11745]
Dilsen S, Paul W, Sandgathe A, Tippe D, Freudl R, Thömmes J, et al. Fed-batch production of recombinant human calcitonin precursor fusion protein using Staphylococcus carnosus as an expression-secretion system. Appl Microbiol Biotechnol. 2000;54(3):361-9. [Link] [DOI:10.1007/s002530000406]
Hong D, Mingqiang Z, Min L, Changqing C, Jifang M. Production of recombinant salmon calcitonin by amidation of precursor peptide using enzymatic transacylation and photolysis in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2000;267(1):362-7. [Link] [DOI:10.1006/bbrc.1999.1961]
Ishikawa H, Kawaguchi J, Yao Y, Tamaoki H, Ono T, Fukui F, et al. Large-scale preparation of recombinant human calcitonin from a multimeric fusion protein produced in Escherichia coli. J Biosci Bioeng. 1999;87(3):296-301. [Link] [DOI:10.1016/S1389-1723(99)80035-8]
Ivanov I, Gigova L, Jay E. Chemical synthesis and expression in E. coli of a human Val8-calcitonin gene by fusion to a synthetic human interferon-gamma gene. FEBS Lett. 1987;210(1):56-60. [Link] [DOI:10.1016/0014-5793(87)81297-8]
Sandgathe A, Tippe D, Dilsen S, Meens J, Halfar M, Weuster-Botz D, et al. Production of a human calcitonin precursor with Staphylococcus carnosus: Secretory expression and single-step recovery by expanded bed adsorption. Process Biochem. 2003;38(9):1351-63. [Link] [DOI:10.1016/S0032-9592(02)00332-1]
Tajima M, Iida T, Kaminuma T, Yanagi M, Fukushima S. High-level synthesis in Escherichia coli of recombinant human calcitonin: Collagenase cleavage of the fusion protein and peptidylglycine α-amidation. J Ferment Bioeng. 1991;72(5):362-7. [Link] [DOI:10.1016/0922-338X(91)90088-X]
Takahashi KI, Liu YC, Hayashi N, Goto F, Kato M, Kawashima H, et al. Production of bioactive salmon calcitonin from the nonendocrine cell lines COS-7 and CHO. Peptides. 1997;18(3):439-44. [Link] [DOI:10.1016/S0196-9781(96)00336-1]
Wang Y, Zeng B, Li X. Expression of human calcitonin by microencapsulated recombinant myoblasts. Biotechnol Lett. 2006;28(18):1453-8. [Link] [DOI:10.1007/s10529-006-9115-6]