کلونینگ ژن Tpel کلستریدیوم پرفرینجنز در باکتری اشریشیا کلی

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد ارومیه، دانشگاه آزاد اسلامی، ارومیه، ایران

2 موسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران

چکیده
توکسین Tpel کلستریدیوم پرفرینجنز با فعالیت سیتوتوکسیتی در تیپ‌های A، B و C در سال‌های اخیر شناسایی شده است. ﺑﺎﻛﺘﺮی کلستریدیوم پرفرینجنز ﺣﺪاﻗﻞ ۱۵ ﻧﻮع ﺗﻮﻛﺴﻴﻦ ﻣﺨﺘﻠﻒ ﺗﻮﻟﻴﺪ میﻛﻨﺪ ﻛﻪ در ﺑﻴﻤﺎری‌زایی آن ﻧﻘﺶ دارﻧﺪ. ﺑﺮاﺳﺎس ﺗﻮﻟﻴﺪ ﭼﻬﺎر ﺗﻮﻛﺴﻴﻦ ﻣﻬﻢ و اصلی آﻟﻔﺎ، ﺑﺘﺎ، اﭘﺴﻴﻠﻮن و ﻳﻮﺗﺎ در ﭘﻨﺞ ﮔﺮوه A، B، C، D و E قرار داده ﺷﺪه اﺳﺖ. در این تحقیق از کلستریدیوم پرفرینجنز تیپ B استفاده شد. توکسین Tpel موجب ایجاد بیماری‌های روده‌ای به‌ویژه عفونت‌های روده‌ای در انسان و بیماری آنتریت‌نکروتیک طیور می‌شود. در این مطالعه DNA ژنومی کامل به روش فنل- کلروفرم استخراج و از روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) برای جداسازی ژن Tpel به‌وسیله یک جفت پرایمر اختصاصی از DNA ژنومی کامل باکتری استفاده شد. محصول PCR پس از اتصال به وکتور pTZ۵۷RL/T به روش TA-کلونینگ در باکتری اشریشیا کلی (E. coli) سویه TOP۱۰ مستعد کلون شد و سپس روش PCR کلونی برای غربالگری کلونی‌های باکتری ترانسفورم‌شده با پلاسمید نوترکیب به کار رفت. وجود قطعه مورد نظر روی ژل آگارز ۱٪ نشان داد که ژن Tpel در اشریشیا کلی سویه TOP۱۰ کلون شده است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


1- Pilehchian Langroudi R, Shamsara M, Aghaiypour K. Expression of Clostridium perfringens epsilon-beta fusion toxin gene in E. coli and its immunologic studies in mouse. Vaccine. 2013;31(32):3295-9. [Link] [DOI:10.1016/j.vaccine.2013.04.061]
Ryan KJ, George Ray C, Sherris JC. Sherris medical microbiology: An introduction to infectious diseases. Ryan KJ, George Ray C, editors. 4th Edition. New York: McGraw-Hill; 2004. [Link]
Warrell DA, Cox TM, Firth JD. Oxford textbook of medicine. 4th Edition. Oxford: Oxford University Press; 2010. [Link] [DOI:10.1093/med/9780199204854.001.1]
Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Medical microbiology. Bahador A, translator. Tehran: Khosravi; 2013. pp. 334-49. [Persian] [Link]
Popoff MR, Bouvet P. Clostridial toxins. Future Microbiol. 2009;4(8):1021-64. [Link] [DOI:10.2217/fmb.09.72]
Schirmer J, Aktories K. Large clostridial cytotoxins: Cellular biology of Rho/Ras-glucosylating toxins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 2004;1673(1-2):66-74. [Link] [DOI:10.1016/j.bbagen.2004.03.014]
Chen J, Mc Clane BA. Characterization of Clostridium perfringens TpeL toxin gene carriage, production, cytotoxic contributions, and trypsin sensitivity. Infect Immun. 2015;83(6):2369-81. [Link] [DOI:10.1128/IAI.03136-14]
Paredes-Sabja D, Sarker N, Sarker MR. Clostridium perfringens tpeL is expressed during sporulation. Microb Pathog. 2011;51(5):384-8. [Link] [DOI:10.1016/j.micpath.2011.05.006]
Fairweather NF, Pickard DJ, Morrissey PM, Lyness VA, Dougan G. Genetic analysis of toxin determinants of Clostridium Perfringens. In: Borriello SP, Hardie JM, Drasar BS, Duerden BI, Hudson MJ, Lysons RJ, editors. Recent Advances in Anaerobic Bacteriology, new perspectives in clinical microbiology. 12th Volume. Dordrecht: Springer; 1987. pp. 38-147. [Link] [DOI:10.1007/978-94-009-3293-7_13]
Pilehchian Langroudi R, Aghaei Pour K, Shamsara M, Jabbari AR, Habibi GR, Goudarzi H, et al. Fusion of Clostridium perfringens type D and B epsilon and beta toxin genes and it's cloning in E. coli. Arch Razi Inst. 2011;66(1):1-10. [Link]
Walch, G, Knapp M, Rainer G, Peintner U. Colony-PCR Is a Rapid Method for DNA Amplification of Hyphomycetes. J. Fungi. 2016;2(2):12. [Link] [DOI:10.3390/jof2020012]
Tomar NR, Kumar R, Kumar A. Glycoprotein based phylogenetic analysis of rabies virus isolates. Int J Curr Microbiol App Sci. 2017;6(7):1727-34. [Link] [DOI:10.20546/ijcmas.2017.607.208]
Clarke JM. Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1988;16(20):9677-86. [Link] [DOI:10.1093/nar/16.20.9677]
Holton TA, Graham mw. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Res. 1990;19(5):1156. [Link] [DOI:10.1093/nar/19.5.1156]
Kovalic D, Kwak JH, Weisblum B. General method for direct cloning of DNA fragments generated by the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 1991;19(16):4560. [Link] [DOI:10.1093/nar/19.16.4560]
Chulman J, Sangmee AJ. A Simple Method to Construct T-Vectors Using XcmI Cassettes Amplified by Nonspecific PCR. Plasmid. 2001;45(1):37-40. [Link] [DOI:10.1006/plas.2000.1500]
Jun SY, Yoon SJ, Kang SH. One-Step Preparation of a TA-cloning Vector from a Specially Designed Parent Plasmid Containing a Dual lacZ Gene System. Mol Biotechnol. 2010;45(1):9-14. [Link] [DOI:10.1007/s12033-009-9233-1]