تعیین توالی، کلونینگ و بیان چپرون DnaK از باکتری باسیلوس هالودورانس سویه Guj1

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران، جهاد دانشگاهی، تهران، ایران

چکیده
اعضای خانواده پروتئین‌های شوک حرارتی ۷۰ (Hsp۷۰) از اجزای مرکزی شبکه سلولی چپرون‌های مولکولی و کاتالیزکننده‌های تاخوردگی هستند. ژن کدکننده یک پروتئین مربوط به Hsp۷۰ یا DnaK در حوزه باکتری‌ها dnaK نامیده می‌شود. پروتئین‌های DnaK در تاخوردگی ازنو پروتئین، تشکیل و تفکیک کمپلکس‌های پروتئینی و تخریب پروتئین‌های بدتاخورده دخیل هستند. ژن dnaJ که کدکننده Hsp۴۰ در باکتری‌ها است، با نقش کوچپرونی تنظیم‌کننده فعالیت‌های DnaK است. در این مطالعه، DnaK از باکتری باسیلوس هالودورانس Guj۱ (Bacillus halodurans Guj۱) را شناسایی، کلون و بیان شد. ژن dnaK از باسیلوس هالودورانس Guj۱، با استفاده از سیستم‌ بیانیpET-۲۸a+ به‌طور موفقیت‌آمیز در اشریشیا کلی سویه BL۲۱ (DE۳) بیان شد. قالب صحیح خوانش ژن کلون‌شده، دارای ۱۸۳۹جفت‌باز بوده که کدکننده ۶۱۲ باقی‌مانده آمینواسیدی است. وزن مولکولی و pI محاسبه‌شده پروتئین به‌ترتیب ۱۸/۶۶کیلودالتون و ۵۵/۴ است. توالی آمینواسیدی به‌دست‌آمده باسیلوس هالودورانس Guj۱ حدود ۶۰% با همتای خود در E. coli یکسانی دارد. ساختار سه‌بعدی DnaK در باسیلوس هالودورانس با الگو قراردادن ساختار کریستالی BiP (عضوی از خانواده HSP۷۰ در انسان) ساخته شد، که نشان‌دهنده یکسانی ۸۸/۰۸% با هم است. DnaK نوترکیب که توسط تیمار حرارتی به‌طور جزئی خالص شد، در SDS-PAGE یک باند تقریبا ۷۰کیلودالتونی دارد. یافته‌های ما نشان داد که DnaK نوترکیب، بهبوددهنده کارآیی ۲۷% دوباره تاخوردگی کربونیک‌انهیدراز بعد از قرارگیری در °C۵۴ به‌مدت یک‌ساعت است. بنابر نتایج به‌دست‌آمده، DnaK از باسیلوس هالودورانس به‌طور ذاتی می‌تواند به‌منظور بهبود ویژگی‌های عملکردی آنزیم‌ها و پروتئین‌ها، در کاربردهای مختلف استفاده شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Smith HL, Li W, Cheetham ME. Molecular chaperones and neuronal proteostasis. Semin Cell Dev Biol. 2015;40:142-52. [Link] [DOI:10.1016/j.semcdb.2015.03.003]
Dobson CM, Šali A, Karplus M. Protein folding: A perspective from theory and experiment. Angew Chem Int Ed Engl. 1998;37(7):868-93.
https://doi.org/10.1002/(SICI)1521-3773(19980420)37:7<868::AID-ANIE868>3.0.CO;2-H [Link] [DOI:10.1002/(SICI)1521-3773(19980420)37:73.0.CO;2-H]
Izaddoust Kordmahaleh M, Ghafoori H, Sarikhan S, Heidari B. Identification and sequence analysis of cDNA encoding the 90-kDa heat shock protein (Hsp90) from the Caspian kutum Rutilus frisii kutum. Aquat Physiol Biotechnol. 2017;4(4):1-12. [Persian] [Link]
Hartl FU, Bracher A, Hayer-Hartl M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 2011;475(7356):324-32. [Link] [DOI:10.1038/nature10317]
Liberek K, Marszalek J, Ang D, Georgopoulos C, Zylicz M. Escherichia coli DnaJ and GrpE heat shock proteins jointly stimulate ATPase activity of DnaK. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(7):2874-8. [Link] [DOI:10.1073/pnas.88.7.2874]
Zhu X, Zhao X, Burkholder WF, Gragerov A, Ogata CM, Gottesman ME, et al. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK. Science. 1996;272(5268):1606-14. [Link] [DOI:10.1126/science.272.5268.1606]
Mayer MP, Bukau B. Hsp70 chaperones: Cellular functions and molecular mechanism. Cell Mol Life Sci. 2005;62(6):670-84. [Link] [DOI:10.1007/s00018-004-4464-6]
Rappa F, Farina F, Zummo G, David S, Campanella C, Carini F, et al. HSP-molecular chaperones in cancer biogenesis and tumor therapy: An overview. Anticancer Res. 2012;32(12):5139-50. [Link]
Stefani M, Dobson CM. Protein aggregation and aggregate toxicity: New insights into protein folding, misfolding diseases and biological evolution. J Mol Med (Berl). 2003;81(11):678-99. [Link] [DOI:10.1007/s00109-003-0464-5]
Yamaguchi H, Miyazaki M. Refolding techniques for recovering biologically active recombinant proteins from inclusion bodies. Biomolecules. 2014;4(1):235-51. [Link] [DOI:10.3390/biom4010235]
Jia Q, Luo Y. The selective roles of chaperone systems on over-expression of human-like collagen in recombinant Escherichia coli. J Ind Microbiol Biotechnol. 2014;41(11):1667-75. [Link] [DOI:10.1007/s10295-014-1500-x]
Nishihara K, Kanemori M, Kitagawa M,Yanagi H, Yura T. Chaperone coexpression plasmids: differential and synergistic roles of DnaK-DnaJ-GrpE and GroEL-GroES in assisting folding of an allergen of Japanese cedar pollen, Cryj2, in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 1998;64(5):1694-9. [Link]
Nishihara K, Kanemori M, Kitagawa M, Yanagi H, Yura T. Chaperone coexpression plasmids: Differential and synergistic roles of DnaK-DnaJ-GrpE and GroEL-GroES in assisting folding of an allergen of Japanese cedar pollen, Cryj2, in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 1998;64(5):1694-9. [Link]
Ghafoori H, Askari M, Sarikhan S. Molecular cloning, expression and functional characterization of the 40-kDa heat shock protein, DnaJ, from Bacillus halodurans. Process Biochem. 2017;54:33-40. [Link] [DOI:10.1016/j.procbio.2016.12.017]
Schlecht R, Erbse AH, Bukau B, Mayer MP. Mechanics of Hsp70 chaperones enables differential interaction with client proteins. Nat Struct Mol Biol. 2011;18(3):345-51. [Link] [DOI:10.1038/nsmb.2006]
Bertelsen EB, Chang L, Gestwicki JE, Zuiderweg ER. Solution conformation of wild-type E. coli Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(21):8471-6. [Link] [DOI:10.1073/pnas.0903503106]
Nicoll WS, Boshoff A, Ludewig MH, Hennessy F, Jung M, Blatch GL. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Expr Purif. 2006;46(1):1-15. [Link] [DOI:10.1016/j.pep.2005.08.005]
Yang J, Nune M, Zong Y, Zhou L, Liu Q. Close and allosteric opening of the polypeptide-binding site in a human Hsp70 chaperone BiP. Structure. 2015;23(12):2191-203. [Link] [DOI:10.1016/j.str.2015.10.012]