تاثیر جهش در جایگاه 330 آنزیم لوسیفراز بر ساختار و عملکرد

نویسندگان

گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده
لوسیفراز حشره شب‌تاب P. py یک آنزیم پراکسیزومی است که موجب تبدیل سوبسترای هتروسیکلیک لوسیفرین به یک حدواسط اکسی‌لوسیفرین در حضور Mg–ATP و اکسیژن مولکولی می‌شود. اکسی‌لوسیفرین برانگیخته با نشر نور مریی به حالت پایه می‌رسد. لومینسانس به دلایل متعددی از جمله سرعت سنجش، حساسیت بالا و آسان‌بودن روش کار، کاربرد وسیعی دارد. برخلاف کاربرد متعدد، لوسیفراز در برابر تغییرات فیزیکی و شیمیایی بسیار حساس است بنابراین حساسیت و دقت آن کاهش می‌یابد. لوسیفراز در برابر دماهای بالا و هضم پروتئولیتیکی بسیار ناپایدار است. براساس مطالعات قبلی، با پروتئولیز محدود این آنزیم توسط تریپسین، شش جایگاه برش در دو ناحیه سطحی پروتئین واقع در دمین انتهای N شناسایی شد ۲۲۰-۲۰۶ (شامل K۲۰۶، R۲۱۳ و R۲۱۸) و ۳۴۱-۳۲۹ (شامل K۳۲۹، R۳۳۰ و R۳۳۷). در این مطالعه، جهش‌زایی هدفدار در ناحیه R۳۳۰ صورت گرفت که آرژنین با گلوتامین جایگزین شد و اثر آن بر ساختار و عملکرد لوسیفراز مورد بررسی قرار گرفت. براساس نتایج پروتئولیز محدود، این جهش تاثیر قابل توجهی نسبت به نمونه وحشی نداشت اما چندین تغییر مانند تغییر pH اپتیمم از ۵/۷ به ۸ و افزایش غیرفعال‌شدن حرارتی در خصوصیات آنزیم ایجاد کرد. براساس نتایج، اگرچه آرژنین ۳۳۰ یک رزیدوی حفاظت‌شده است ولی روی پایداری در برابر هضم پروتئولیتیکی تریپسین تاثیری نداشت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Alex McDermott F. The stability of the photogenic material of the Lampyridae and its probable chemical nature. J Am Chem Soc. 1911;33(11):1791-7. [Link] [DOI:10.1021/ja02224a018]
Meighen EA. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol Rev. 1991;55(1):123-42. [Link]
Said Alipour B, Hosseinkhani S, Ardestani SK, Moradi A. The effective role of positive charge saturation in bioluminescence color and thermostability of firefly luciferase. Photochem Photobiol Sci. 2009;8(6):847-55. [Link] [DOI:10.1039/b901938c]
Dementieva EI, Fedorchuk EA, Brovko LY, Savitskii AP, Ugarova NN. Fluorescent properties of firefly luciferases and their complexes with luciferin. Biosci Rep. 2000;20(1):21-30. [Link] [DOI:10.1023/A:1005579016387]
McElroy WD, DeLuca M, Travis J. Molecular uniformity in biological catalyses. The enzymes concerned with firefly luciferin, amino acid, and fatty acid utilization are compared. Science. 1967;157(3785):150-60. [Link] [DOI:10.1126/science.157.3785.150]
Cook SH, Griffin DE. Luciferase imaging of a neurotropic viral infection in intact animals. J Virol. 2003;77(9):5333-8. [Link] [DOI:10.1128/JVI.77.9.5333-5338.2003]
Ye L, Buck LM, Schaeffer HJ, Leach FR. Cloning and sequencing of a cDNA for firefly luciferase from Photuris pennsylvanica. Biochim Biophys Acta. 1997;1339(1):39-52. [Link] [DOI:10.1016/S0167-4838(96)00211-7]
Weng YH, Tatarov A, Bartos BP, Contag CH, Dennery PA. HO-1 expression in type II pneumocytes after transpulmonary gene delivery. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000;278(6):L1273-9. [Link] [DOI:10.1152/ajplung.2000.278.6.L1273]
Bhaumik S, Gambhir SS. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(1):377-82. [Link] [DOI:10.1073/pnas.012611099]
Torkzadeh-Mahani M, Ataei F, Nikkhah M, Hosseinkhani S. Design and development of a whole-cell luminescent biosensor for detection of early-stage of apoptosis. Biosens Bioelectron. 2012;38(1):362-8. [Link] [DOI:10.1016/j.bios.2012.06.034]
Spielmann H, Jacob-Müller U, Schulz P. Simple assay of 0.1-1.0 pmol of ATP, ADP, and AMP in single somatic cells using purified luciferin luciferase. Anal Biochem. 1981;113(1):172-8. [Link] [DOI:10.1016/0003-2697(81)90061-0]
Thompson JF, Geoghegan KF, Lloyd DB, Lanzetti AJ, Magyar RA, Anderson SM, et al. Mutation of a protease-sensitive region in firefly luciferase alters light emission properties. J Biol Chem. 1997;272(30):18766-71. [Link] [DOI:10.1074/jbc.272.30.18766]
Govardhan CP. Crosslinking of enzymes for improved stability and performance. Curr Opin Biotechnol. 1999;10(4):331-5. [Link] [DOI:10.1016/S0958-1669(99)80060-3]
Ganjalikhany MR, Ranjbar B, Hosseinkhani S, Khalifeh Kh, Hassani L. Roles of trehalose and magnesium sulfate on structural and functional stability of firefly luciferase. J Mol Catal B Enzym. 2010;62(2):127-32. [Link] [DOI:10.1016/j.molcatb.2009.09.015]
Yousefi Nejad M, Hosseinkhani S, Khajeh Kh, Ranjbar B. Expression, purification and immobilization of firefly luciferase on alkyl-substituted Sepharose 4B. Enzyme Microb Technol. 2007;40(4):740-6. [Link] [DOI:10.1016/j.enzmictec.2006.06.023]
Gocht M, Marahiel MA. Analysis of core sequences in the D-Phe activating domain of the multifunctional peptide synthetase TycA by site-directed mutagenesis. J Bacteriol. 1994;176(9):2654-62. [Link] [DOI:10.1128/jb.176.9.2654-2662.1994]
Branchini BR, Magyar RA, Murtiashaw MH, Portier NC. The role of active site residue arginine 218 in firefly luciferase bioluminescence. Biochemistry. 2001;40(8):2410-8. [Link] [DOI:10.1021/bi002246m]
Riahi Madvar A, Hosseinkhani S. Design and characterization of novel trypsin-resistant firefly luciferases by site-directed mutagenesis. Protein Eng Des Sel. 2009;22(11):655-63. [Link] [DOI:10.1093/protein/gzp047]
Wang W, Malcolm BA. Two-stage PCR protocol allowing introduction of multiple mutations, deletions and insertions using QuikChange Site-Directed Mutagenesis. Biotechniques. 1999;26(4):680-2. [Link] [DOI:10.2144/99264st03]
Ataei F, Hosseinkhani S, Khajeh Kh. Limited proteolysis of luciferase as a reporter in nanosystem biology: A comparative study. Photochem Photobiol. 2009;85(5):1162-7. [Link] [DOI:10.1111/j.1751-1097.2009.00583.x]