کلونینگ، بیان و تعیین ویژگی پروتئین نوترکیب بخش اکتودومین گیرنده پروتئین مورفوژنتیک استخوان در میزبان پروکاریوتی

نوع مقاله : پژوهشی اصیل

نویسندگان

1 گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

2 گروه زیست‌فناوری دامی، پژوهشکده زیست‌فناوری کشاورزی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست‌فناوری تهران، ایران

چکیده
پروتئین‌های مورفوژنتیک استخوانی (BMPs) متعلق به سوپرفامیلی فاکتور ترنسفورم‌کننده رشد بتا هستند. این مولکول‌ها در رشد و تکوین جنینی و همچنین تمایز سلول‌های مختلف نقش ایفا می‌کنند. در این خصوص دو مولکول همودایمر BMP-۲ و BMP-۷ نقش مهمی در تشکیل اکتوپیک استخوان دارند به‌طوری که دو نوع نوترکیب آن به‌صورت استفاده اکتوپیک در دسترس هستند. بعد از اتصال همودایمر BMP-۲ به گیرنده خود در سطح سلول، تجمع همودایمرهای نوع I و II گیرنده آن منجر به ایجاد پاسخ بیولوژیک در داخل سلول می‌شود. علی‌رغم وجود انواع نوترکیب BMP-۲ و BMP-۷ به‌دلیل خطرات ناشی از استفاده از آنها هنوز استراتژی استفاده از انواع آندوژن از طریق به دام‌انداختن با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال در محل ضایعه استخوانی در اولویت برنامه‌های تحقیقاتی است. روش جایگزین دیگر به‌جای استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال استفاده از گیرنده‌های طبیعی این لیگاند در بدن است. در این رابطه با توجه به Kd مناسب اتصال بخش اکتودمین گیرنده II مولکول BMP-۲ در این پروژه اقدام به بیان و تخلیص این قسمت با هدف به دام‌انداختن BMP-۲ اندوژن شد. قطعه پروتئینی اکتودمین گیرنده نوع II در میزبان باکتریایی بیان و تخلیص شد که با ارزیابی CD این پروتئین نوترکیب حاکی از ساختار مشابه با نوع طبیعی آن بود. همچنین ارزیابی اتصال آن به لیگاند BMP-۲ با الایزا مورد بررسی قرار گرفت و در ادامه Kd آن محاسبه شد. براساس نتایج به‌دست‌آمده، بخش اکتودمین گیرنده نوع دو می‌تواند با ویژگی اتصال مناسب در غلظت نانومولار به BMP-۲ متصل شود و در مطالعات بعدی می‌تواند به‌عنوان یک جایگزین به‌جای آنتی‌بادی مونوکلونال برای به دام‌اندازی مولکول‌های BMP آندوژن مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Urist MR. Bone: formation by autoinduction. Science. 1965;150(3698):893-9. [Link] [DOI:10.1126/science.150.3698.893]
ten Dijke P, Korchynskyi O, Valdimarsdottir G, Goumans MJ. Controlling cell fate by bone morphogenetic protein receptors. Mol Cell Endocrinol. 2003;211(1-2):105-13. [Link] [DOI:10.1016/j.mce.2003.09.016]
Sasikumar KP, Elavarasu S, Gadagi JS. The application of bone morphogenetic proteins to periodontal and peri-implant tissue regeneration: a literature review. J Pharm Bioallied Sci. 2012;4(Suppl 2):S427-30. [Link] [DOI:10.4103/0975-7406.100320]
Mace PD, Cutfield JF, Cutfield SM. Bacterial expression and purification of the ovine type II bone morphogenetic protein receptor ectodomain. Protein Expr Purif. 2007;52(1):40-9. [Link] [DOI:10.1016/j.pep.2006.07.025]
Shimasaki S, Moore RK, Otsuka F, Erickson GF. The bone morphogenetic protein system in mammalian reproduction. Endocr Rev. 2004;25(1):72-101. [Link] [DOI:10.1210/er.2003-0007]
ten Dijke P, Yamashita H, Ichijo H, Franzén P, Laiho M, Miyazono K, et al. Characterization of type I receptors for transforming growth factor-beta and activin. Science. 1994;264(5155):101-4. [Link] [DOI:10.1126/science.8140412]
Rosenzweig BL, Imamura T, Okadome T, Cox GN, Yamashita H, ten Dijke P, et al. Cloning and characterization of a human type II receptor for bone morphogenetic proteins. Proc Natl Acad Sci. 1995;92(17):7632-6. [Link] [DOI:10.1073/pnas.92.17.7632]
Garrison KR, Donell S, Ryder J, Shemilt I, Mugford M, Harvey I, et al. Clinical effectiveness and cost-effectiveness of bone morphogenetic proteins in the non-healing of fractures and spinal fusion: a systematic review. Health Technol Assess. 2007;11(30):1-150, iii-iv. [Link] [DOI:10.3310/hta11300]
McKay WF, Peckham SM, Badura JM. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE® Bone Graft). Int Orthop. 2007;31(6):729-34. [Link] [DOI:10.1007/s00264-007-0418-6]
Freire MO, You HK, Kook JK, Choi JH, Zadeh HH. Antibody-mediated osseous regeneration: a novel strategy for bioengineering bone by immobilized anti-bone morphogenetic protein-2 antibodies. Tissue Eng Part A. 2011;17(23-24):2911-8. [Link] [DOI:10.1089/ten.tea.2010.0584]
Freire MO, Kim HK, Kook JK, Nguyen A, Zadeh HH. Antibody-mediated osseous regeneration: the early events in the healing response. Tissue Eng Part A. 2013;19(9-10):1165-74. [Link] [DOI:10.1089/ten.tea.2012.0282]
Ansari S, Freire M, Choi MG, Tavari A, Almohaimeed M, Moshaverinia A, et al. Effects of the orientation of anti-BMP2 monoclonal antibody immobilized on scaffold in antibody-mediated osseous regeneration. J Biomater Appl. 2015;30(5):558-67. [Link] [DOI:10.1177/0885328215594704]
Hosseinpour S, Rad MR, Khojasteh A, Zadeh HH. Antibody administration for bone tissue engineering: a systematic review. Curr Stem Cell Res Ther. 2018;13(4):292-315. [Link] [DOI:10.2174/1574888X13666180207095314]
Mace PD, Cutfield JF, Cutfield SM. High resolution structures of the bone morphogenetic protein type II receptor in two crystal forms: implications for ligand binding. Biochem Biophys Res Commun. 2006;351(4):831-8. [Link] [DOI:10.1016/j.bbrc.2006.10.109]
Boesen CC, Motyka SA, Patamawenu A, Sun PD. Development of a recombinant bacterial expression system for the active form of a human transforming growth factor β type II receptor ligand binding domain. Protein Expr Purif. 2000;20(1):98-104. [Link] [DOI:10.1006/prep.2000.1306]
Kirsch T, Nickel J, Sebald W. Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP‐2. FEBS Lett. 2000;468(2-3):215-9. [Link] [DOI:10.1016/S0014-5793(00)01214-X]
Goetschy JF, Letourneur O, Cerletti N, Horisberger MA. The unglycosylated extracellular domain of type-II receptor for transforming growth factor-beta. A novel assay for characterizing ligand affinity and specificity. Eur J Biochem. 1996;241(2):355-62. [Link] [DOI:10.1111/j.1432-1033.1996.00355.x]
Greenwald J, Le V, Corrigan A, Fischer W, Komives E, Vale W, et al. Characterization of the extracellular ligand-binding domain of the type II activin receptor. Biochemistry. 1998;37(47):16711-8. [Link] [DOI:10.1021/bi981939o]
Allendorph GP, Vale WW, Choe S. Structure of the ternary signaling complex of a TGF-β superfamily member. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(20):7643-8. [Link] [DOI:10.1073/pnas.0602558103]
Greenwald J, Groppe J, Gray P, Wiater E, Kwiatkowski W, Vale W, et al. The BMP7/ActRII extracellular domain complex provides new insights into the cooperative nature of receptor assembly. Mol Cell. 2003;11(3):605-17. [Link] [DOI:10.1016/S1097-2765(03)00094-7]
Clark EDB. Refolding of recombinant proteins. Curr Opin Biotechnol. 1998;9(2):157-63. [Link] [DOI:10.1016/S0958-1669(98)80109-2]
Lilie H, Schwarz E, Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in E. coli. Curr Opin Biotechnol. 1998;9(5):497-501. [Link] [DOI:10.1016/S0958-1669(98)80035-9]
Martineau P. Affinity measurements by competition ELISA. In: Kontermann R, Dubel S, editors. Antibody engineering. Volume 1. 2nd Edition. Berlin: Springer; 2010. p. 657-65. [Link] [DOI:10.1007/978-3-642-01144-3_41]
Miyazono K, Maeda S, Imamura T. Coordinate regulation of cell growth and differentiation by TGF-β superfamily and Runx proteins. Oncogene. 2004;23(24):4232-7. [Link] [DOI:10.1038/sj.onc.1207131]
Nakashima K, Zhou X, Kunkel G, Zhang Z, Deng JM, Behringer RR, et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 2002;108(1):17-29. [Link] [DOI:10.1016/S0092-8674(01)00622-5]
Tsuji K, Bandyopadhyay A, Harfe BD, Cox K, Kakar S, Gerstenfeld L, et al. BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing. Nat Genet. 2006;38(12):1424-9. [Link] [DOI:10.1038/ng1916]
Nakashima M, Reddi AH. The application of bone morphogenetic proteins to dental tissue engineering. Nat Biotechnol. 2003;21(9):1025-32. [Link] [DOI:10.1038/nbt864]
Nickel J, Dreyer MK, Kirsch T, Sebald W. The crystal structure of the BMP-2: BMPR-IA complex and the generation of BMP-2 antagonists. J Bone Joint Surg Am. 2001;83-A Suppl 1(Pt 1):S7-14. [Link] [DOI:10.2106/00004623-200100001-00002]