تخلیص فیوژن پپتید نوترکیب حاوی تگ تمایلی به هیدروکسی‌آپاتیت با کمک ستون کروماتوگرافی سرامیکی

نوع مقاله : پژوهشی اصیل

نویسندگان

1 گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

2 آزمایشگاه تنظیمات ایمنی و مهندسی بافت، دانشکده دندانپزشکی، دانشگاه کالیفرنیای جنوبی، لس‌آنجلس، ایالات‌متحده

چکیده
مقدمه: امروزه ترمیم بافت استخوانی با افزایش اختلالات و آسیب‌های استخوانی از اهمیت خاصی برخوردار است. مهندسی بافت استخوان، راهکارهای ویژه‌ای را برای رفع این مشکلات فراهم کرده است. مطالعه حاضر با هدف تخلیص فیوژن پپتید نوترکیب حاوی تگ تمایلی به هیدروکسی‌آپاتیت با کمک ستون کروماتوگرافی سرامیکی انجام شد.

مواد و روش‌ها: در مطالعه حاضر، نوعی پپتید فیوژن طراحی شد که از یک‌سو حاوی توالی دمین اتصالی به هپارین بود که می‌تواند به انواع مختلفی از فاکتورهای رشد دخیل در ترمیم بافت متصل و باعث به‌دام‌انداختن این فاکتورها در محل ضایعه شود و از سوی دیگر حاوی یک تگ بود که شامل توالی به‌دست‌آمده از یک مطالعه آزمایشگاهی مبتنی بر بیان فاژی است. علت قراردادن این تگ، اتصال پپتید به داربست حاوی هیدروکسی‌آپاتیت و تخلیص پپتید نوترکیب توسط ستون هیدروکسی‌آپاتیت بود. بنابراین توالی ژن برای بیان در میزبان پروکاریوتی E. coli ﺳﻮﻳﻪ BL۲۱ بهینه‌سازی و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزیم‌های SacI و BamHI در وکتور بیانی pET-۲۱a(+) ساب‌کلون شد. بیان پپتید نوترکیب از طریق روش‌های SDS-PAGE و وسترن‌بلات بررسی شد. برای بهینه‌کردن شرایط تخلیص، با اعمال تغییرات اساسی در روش کار اصلی شرکت سازنده، تخلیص دو مرحله‌ای انجام شد. این پپتید با تمایل بالایی به ستون متصل و با خلوص قابل قبولی تخلیص شد. در نهایت وجود تجمعات پپتیدی از طریق روش DLS بررسی شد.

یافته‌ها: نتایج کلونی PCR، هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم‌های SacI و BamHI و تعیین توالی حاکی از صحت فرآیند کلونینگ بود. از طرفی بیان پپتید فیوژن توسط روش‌های SDS-PAGE و وسترن‌بلات تایید و مهاجرت آن روی ژل باعث ظاهرشدن باندی در حدود ۱۲کیلودالتون شد. تغییرات ایجادشده در روش کار شرکت سازنده باعث شد فرآیند تخلیص به‌صورت مطلوبی انجام شود و در نهایت نتایج روش DLS هم خلوص پپتید تخلیص شده را نشان داد.

نتیجه‌گیری: نتایج نشان‌دهنده بیان مطلوب و خلوص قابل توجه پپتید فیوژن طراحی‌شده در این مطالعه است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


Bettinger CJ, Weinberg EJ, Kulig KM, Vacanti JP, Wang Y, Borenstein JT, et al. Three‐dimensional microfluidic tissue‐engineering scaffolds using a flexible biodegradable polymer. Adv Mater. 2006;18(2):165-9. [Link] [DOI:10.1002/adma.200500438]
Bessa PC, Casal M, Reis RL. Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: The road from the laboratory to the clinic, part I (basic concepts). J Tissue Eng Regen Med. 2008;2(1):1-13. [Link] [DOI:10.1002/term.63]
Black CR, Goriainov V, Gibbs D, Kanczler J, Tare RS, Oreffo RO. Bone tissue engineering. Curr Mol Biol Rep. 2015;1(3):132-40. [Link] [DOI:10.1007/s40610-015-0022-2]
Tang D, Tare RS, Yang LY, Williams DF, Ou KL, Oreffo RO. Biofabrication of bone tissue: Approaches, challenges and translation for bone regeneration. Biomaterials. 2016;83:363-82. [Link] [DOI:10.1016/j.biomaterials.2016.01.024]
Malik MA, Puleo DA, Bizios R, Doremus RH. Osteoblasts on hydroxyapatite, alumina and bone surfaces in vitro; Morphology during the first 2h of attachment. Biomaterials. 1992;13(2):123-8. [Link] [DOI:10.1016/0142-9612(92)90008-C]
Pilipchuk SP, Plonka AB, Monje A, Taut AD, Lanis A, Kang B, et al. Tissue engineering for bone regeneration and osseointegration in the oral cavity. Dent Mater. 2015;31(4):317-38. [Link] [DOI:10.1016/j.dental.2015.01.006]
Martino MM, Briquez PS, Ranga A, Lutolf MP, Hubbell JA. Heparin-binding domain of fibrin (ogen) binds growth factors and promotes tissue repair when incorporated within a synthetic matrix. Proc Natl Acad Sci. 2013;110(12):4563-8. [Link] [DOI:10.1073/pnas.1221602110]
Rosa PAJ, Ferreira IF, Azevedo AM, Aires-Barros MR. Aqueous two-phase systems: A viable platform in the manufacturing of biopharmaceuticals. J Chromatogr A. 2010;1217(16):2296-305. [Link] [DOI:10.1016/j.chroma.2009.11.034]
Azevedo AM, Rosa PAJ, Ferreira IF, Raquel Aires-Barros M. Chromatography-free recovery of biopharmaceuticals through aqueous two-phase processing. Trends Biotechnol. 2009;27(4):240-7. [Link] [DOI:10.1016/j.tibtech.2009.01.004]
Fields C, Li P, O'Mahony JJ, Lee GU. Advances in affinity ligand‐functionalized nanomaterials for biomagnetic separation. Biotechnol Bioeng. 2016;113(1):11-25. [Link] [DOI:10.1002/bit.25665]
Wood DW. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Curr Opin Struct Biol. 2014;26:54-61. [Link] [DOI:10.1016/j.sbi.2014.04.006]
Cummings LJ, Snyder MA, Brisack K. Protein chromatography on hydroxyapatite columns. In: Burgess RR, Deutscher MP, editors. Guide to protein purification. 2nd Edition. Cambridge: Academic Press; 2009. [Link] [DOI:10.1016/S0076-6879(09)63024-X]
Snyder MA. Working with a powerful and robust mixed-mode resin for protein purification. BioProcess Int. 2011;9(5):50-53. [Link]
Roy MD, Stanley SK, Amis EJ, Becker ML. Identification of a highly specific hydroxyapatite‐binding peptide using phage display. Adv Mater. 2008;20(10):1830-6. [Link] [DOI:10.1002/adma.200702322]
He F. Laemmli-sds-page. Bio-protocol. 2011;1(11):e80. [Link] [DOI:10.21769/BioProtoc.80]
He F. Bradford protein assay. Bio-protocol. 2011;1(6):e45. [Link] [DOI:10.21769/BioProtoc.45]
Gagnon P, Frost R, Tunón P, Ogawa T. CHT™ ceramic hydroxyapatite: A new dimension in chromatography of biological molecules [Internet]. Hercules: Bio-Rad Laboratories; 1996 [cited 2018 October 23]. Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/psd/literature/Bulletin_2156.pdf [Link]
Kawasaki T. Theory of chromatography on hydroxyapatite columns with small loads: V. determination of the adsorption energy of the ε-amino group of poly-l-lysine and the manner of adsorption of the molecule. J Chromatogr A. 1978;157:7-42. [Link] [DOI:10.1016/S0021-9673(00)92319-7]
Kawasaki T. Hydroxyapatite as a liquid chromatographic packing. J Chromatogr A. 1991;544:147-84. [Link] [DOI:10.1016/S0021-9673(01)83984-4]
Fernandez-Yague MA, Abbah SA, McNamara L, Zeugolis DI, Pandit A, Biggs MJ. Biomimetic approaches in bone tissue engineering: Integrating biological and physicomechanical strategies. Adv Drug Deliv Rev. 2015;84:1-29. [Link] [DOI:10.1016/j.addr.2014.09.005]
Leach JK, Mooney DJ. Bone engineering by controlled delivery of osteoinductive molecules and cells. Expert Opin Biol Ther. 2004;4(7):1015-27. [Link] [DOI:10.1517/14712598.4.7.1015]
Santo VE, Gomes ME, Mano JF, Reis RL. Controlled release strategies for bone, cartilage, and osteochondral engineering-Part II: Challenges on the evolution from single to multiple bioactive factor delivery. Tissue Eng Part B Rev. 2013;19(4):327-52. [Link] [DOI:10.1089/ten.teb.2012.0727]
Suárez-González D, Lee JS, Diggs A, Lu Y, Nemke B, Markel M, et al. Controlled multiple growth factor delivery from bone tissue engineering scaffolds via designed affinity. Tissue Eng Part A. 2013;20(15-16):2077-87. [Link] [DOI:10.1089/ten.tea.2013.0358]
Mouriño V, Cattalini JP, Roether JA, Dubey P, Roy I, Boccaccini AR. Composite polymer-bioceramic scaffolds with drug delivery capability for bone tissue engineering. Expert Opin Drug Deliv. 2013;10(10):1353-65. [Link] [DOI:10.1517/17425247.2013.808183]
Zhang H, Migneco F, Lin CY, Hollister SJ. Chemically-conjugated bone morphogenetic protein-2 on three-dimensional polycaprolactone scaffolds stimulates osteogenic activity in bone marrow stromal cells. Tissue Eng Part A. 2010;16(11):3441-8. [Link] [DOI:10.1089/ten.tea.2010.0132]
Islam T, Aguilar-Yañez JM, Simental-Martínez J, Ortiz-Alcaraz CI, Rito-Palomares M, Fernandez-Lahore M. A novel strategy for the purification of a recombinant protein using ceramic fluorapatite-binding peptides as affinity tags. J Chromatogr A. 2014;1339:26-33. [Link] [DOI:10.1016/j.chroma.2014.02.079]
Walls D, Loughran ST. Tagging recombinant proteins to enhance solubility and aid purification. In: Walls D, Sinéad D, Loughran ST, editors. Protein chromatography: Methods and protocols. Totowa: Humana Press; 2011. pp. 151-75. [Link] [DOI:10.1007/978-1-60761-913-0_9]