کلون سازی و بیان دُمین خارج سلولی رسپتور 2 VEGF انسانی در پیکیا پاستوریس و بررسی خواص اتصالی آن

نوع مقاله : پژوهشی اصیل

نویسندگان

1 گروه علوم سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی

2 گروه پژوهشی پیشگامان انتقال ژن، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی

3 گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس

چکیده
آنژیوژنز[1] غیرطبیعی با بیماری­های مختلف نظیر سرطان و متاستاز آن، رتینوپاتی و آرتریت روماتوئید در ارتباط است. VEGF-A[2] مهمترین واسطه­ی آنژیوژنز در میان تمام فاکتورهای رشد است. فعالیت زیستی VEGF توسط دو گیرنده تیروزین کینازی VEGFR-1 و VEGFR-2 سلول­های اندوتلیال وساطت می­شود. سیگنالینگ VEGF از طریق VEGFR-2 مسیر اصلی آنژیوژنز است که منجر به تحریک رشد سریع سلول­های اندوتلیال به داخل تومور می­شود. این رسپتور از یک بخش خارج سلولی، یک بخش سیتوپلاسمی و یک دُمین ترانس ممبران تشکیل شده است. بخش خارج سلولی متشکل از هفت دُمین شبه ایمونوگلوبولین (D1-D7) است که دُمین های اول تا سوم به عنوان جایگاه اتصال لیگاند عمل می­کنند. در این مطالعه دُمین های خارج سلولی 3-1 گیرنده (KDR1-3) بصورت نوترکیب در Pichia pastoris بیان شد. یک قطعه DNA 975 نوکلوتیدی حاوی دُمین های 3-1 براساس توالی نوکلئوتیدی در GenBank و توالی پروتئین در Swiss-Prot طراحی شد. وکتور بیانی ترشحی نوترکیب (pPinkαHC/KDR1-3) ساخته شد و به روش الکتروپوریشن به داخل مخمر منتقل شد. سلول های نوترکیب با بیان بالا از طریق تکمیل اگزوتروفی آدنین شناسایی و کشت شدند. KDR1-3 تحت القا با متانول 1٪ بیان و با SDS-PAGE و تکنیک وسترن بلات تایید شد. پس از تخلیص با کروماتوگرافی تمایلی با رزین Ni-NTA، اتصال محصول بیان شده به hVEGF165 با الایزای مستقیم و الایزای مبتنی بر گیرنده اثبات شد. نتایج نشان داد که دُمین خارج سلولی 3-1 گیرنده VEGFR-2 انسانی با ساختار پروتئین یوکاریوتی، که هیچ گزارشی در مورد آن وجود ندارد، با موفقیت بیان شد.


[1] Angiogenesis

[2] Vascular endothelial growth factor-A

کلیدواژه‌ها

موضوعات


1. Folkman, J., Tumor angiogenesis: therapeutic implications. New england journal of medicine, 1971. 285(21): p. 1182-1186.
2. Ferrara, N. and T. Davis-Smyth, The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine reviews, 1997. 18(1): p. 4-25.
3. Waltenberger, J., et al., Different signal transduction properties of KDR and Flt1, two receptors for vascular endothelial growth factor. Journal of Biological Chemistry, 1994. 269(43): p. 26988-26995.
4. Carmeliet, P., et al., Synergism between vascular endothelial growth factor and placental growth factor contributes to angiogenesis and plasma extravasation in pathological conditions. Nature medicine, 2001. 7(5): p. 575.
5. Carmeliet, P., Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature medicine, 2000. 6(4): p. 389.
6. Ferrara, N., H.-P. Gerber, and J. LeCouter, The biology of VEGF and its receptors. Nature medicine, 2003. 9(6): p. 669.
7. Ferrara, N. and H.-P. Gerber, The role of vascular endothelial growth factor in angiogenesis. Acta haematologica, 2001. 106(4): p. 148-156.
8. von Tiedemann, B. and U. Bilitewski, Characterization of the vascular endothelial growth factor–receptor interaction and determination of the recombinant protein by an optical receptor sensor. Biosensors and Bioelectronics, 2002. 17(11-12): p. 983-991.
9. Wise, L.M., et al., Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999. 96(6): p. 3071-3076.
10. Shibuya, M., Differential roles of vascular endothelial growth factor receptor-1 and receptor-2 in angiogenesis. BMB Reports, 2006. 39(5): p. 469-478.
11. Kanno, S., et al., Roles of two VEGF receptors, Flt-1 and KDR, in the signal transduction of VEGF effects in human vascular endothelial cells. Oncogene, 2000. 19(17): p. 2138.
12. Hicklin, D.J. and L.M. Ellis, Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tumor growth and angiogenesis. Journal of clinical oncology, 2005. 23(5): p. 1011-1027.
13. Terman, B.I., et al., Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene, 1991. 6(9): p. 1677-1683.
14. Brekken, R.A., et al., Selective inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor 2 (KDR/Flk-1) activity by a monoclonal anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice. Cancer research, 2000. 60(18): p. 5117-5124.
15. Shinkai, A., et al., Mapping of the sites involved in ligand association and dissociation at the extracellular domain of the kinase insert domain-containing receptor for vascular endothelial growth factor. Journal of Biological Chemistry, 1998. 273(47): p. 31283-31288.
16. Fuh, G., et al., Requirements for binding and signaling of the kinase domain receptor for vascular endothelial growth factor. Journal of Biological Chemistry, 1998. 273(18): p. 11197-11204.
17. Wedge, S.R., et al., AZD2171: a highly potent, orally bioavailable, vascular endothelial growth factor receptor-2 tyrosine kinase inhibitor for the treatment of cancer. Cancer research, 2005. 65(10): p. 4389-4400.
18. Bold, G., et al., A novel potent oral series of VEGFR2 inhibitors abrogate tumor growth by inhibiting angiogenesis. Journal of medicinal chemistry, 2015. 59(1): p. 132-146.
19. Ferrara, N., et al., Vascular endothelial growth factor is essential for corpus luteum angiogenesis. Nature medicine, 1998. 4(3): p. 336.
20. Gerber, H.-P., et al., VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation. Nature medicine, 1999. 5(6): p. 623.
21. Kuo, C.J., et al., Comparative evaluation of the antitumor activity of antiangiogenic proteins delivered by gene transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001. 98(8): p. 4605-4610.
22. Papadopoulos, N., et al., Binding and neutralization of vascular endothelial growth factor (VEGF) and related ligands by VEGF Trap, ranibizumab and bevacizumab. Angiogenesis, 2012. 15(2): p. 171-185.
23. Li, H., et al., The antiangiogenic activity of a soluble fragment of the VEGFR extracellular domain. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2013. 67(7): p. 599-606.
24. Sambrook, H., Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY. 1989.
25. Dehnavi, E., et al., Cloning and high-level expression of β-xylosidase from Selenomonas ruminantium in Pichia pastoris by optimizing of pH, methanol concentration and temperature conditions. Protein expression and purification, 2016. 124: p. 55-61.
26. technologies, I.b.l., PichiaPink Expression System.
27. Shahangian, S.S., et al., A conformation-based phage-display panning to screen neutralizing anti-VEGF VHHs with VEGFR2 mimicry behavior. International journal of biological macromolecules, 2015. 77: p. 222-234.
28. Bahadori, Z., H.R. Kalhor, and S.J. Mowla, Producing functional recombinant human keratinocyte growth factor in Pichia pastoris and investigating its protective role against irradiation. Enzyme and microbial technology, 2018. 111: p. 12-20.
29. Camattari, A., et al., Characterization of a panARS-based episomal vector in the methylotrophic yeast Pichia pastoris for recombinant protein production and synthetic biology applications. Microbial cell factories, 2016. 15(1): p. 139.
30. Cregg, J.M., et al., Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Molecular biotechnology, 2000. 16(1): p. 23-52.
31. Butler, M. and M. Spearman, The choice of mammalian cell host and possibilities for glycosylation engineering. Current opinion in biotechnology, 2014. 30: p. 107-112.
32. Pal, Y., A. Khushoo, and K. Mukherjee, Process optimization of constitutive human granulocyte–macrophage colony-stimulating factor (hGM-CSF) expression in Pichia pastoris fed-batch culture. Applied microbiology and biotechnology, 2006. 69(6): p. 650-657.
33. /P35968, h.w.u.o.
34. Strasser, R., F. Altmann, and H. Steinkellner, Controlled glycosylation of plant-produced recombinant proteins. Current opinion in biotechnology, 2014. 30: p. 95-100.
35. invitrogen by life technologies, P.E.S.u.g.
36. Chen, X., J.L. Zaro, and W.-C. Shen, Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced drug delivery reviews, 2013. 65(10): p. 1357-1369.
37. Cunningham, S.A., et al., Interactions of FLT-1 and KDR with phospholipase C γ: identification of the phosphotyrosine binding sites. Biochemical and biophysical research communications, 1997. 240(3): p. 635-639.
38. Invitrogen by life technologies, EasySelect Pichia Expression Kit For Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris.
39. Puxbaum, V., D. Mattanovich, and B. Gasser, Quo vadis? The challenges of recombinant protein folding and secretion in Pichia pastoris. Applied microbiology and biotechnology, 2015. 99(7): p. 2925-2938.
40. Cereghino, J.L. and J.M. Cregg, Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS microbiology reviews, 2000. 24(1): p. 45-66.
41. Damasceno, L.M., C.-J. Huang, and C.A. Batt, Protein secretion in Pichia pastoris and advances in protein production. Applied microbiology and biotechnology, 2012. 93(1): p. 31-39.