کلونینگ و بیان ژن کدکننده ی نواحی آنتی ژنی پروتئین غیرساختاری 3D ویروس بیماری تب برفکی

نوع مقاله : پژوهشی اصیل

نویسندگان

1 گروه آموزشی سلولی- مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران ، ایران.

2 عضو هیات علمی موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی

3 بخش ژنومیکس و مهندسی ژنتیک، موسسه‌ی تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی، کرج، ایران.

4 بخش تولید واکسن تب برفکی، موسسه ی تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی، کرج، ایران.

5 بخش ژنومیکس و مهندسی ژنتیک، موسسه ی تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی، کرج، ایران.

چکیده
تب برفکی (FMD) بیماری بسیار واگیردار و ویرانگر است که به سرعت انتشار می‌یابد و خسارات اقتصادی زیادی را موجب می‌شود. یکی از روش­های مهم تشخیص بیماری و خصوصا تفکیک حیوان واکسینه شده از حیوان مبتلا به این بیماری، استفاده از پروتئین­های غیرساختاری بعنوان آنتی ژن در کیت­های تشخیصی الایزا می­باشد. هدف از مطالعه­ی حاضر، کلونینگ توالی ژنی و بیان نواحی آنتی­ژنی پروتئین غیر ساختاری 3Dبه عنوان یکی از گزینه­های تشخیصی می­باشد. برای تکثیر ژن کدکننده­ی نواحی آنتی­ژنی پروتئین 3D ویروس تب برفکی، آغازگرهای اختصاصی دارای جایگاه برشی آنزیم های NdeI و EcoRI طراحی شد و واکنش زنجیره ای پلیمراز انجام شد. ژن برش خورده توسط این دو آنزیم، به ناقل PET21a+ انتقال داده شد و در باکتری های اشرشیاکلی DH5α ترنسفورم شد. آزمایشات کلونی-PCR و برش آنزیمی بر روی کلونی های حاصل انجام و حضور ژن هدف تایید شد. توالی ژنی نیز پس از توالی­یابی تایید شد. برای تولید آنتی ژن نوترکیب، وکتور بیانی نوترکیب به میزبان بیانی باکتری اشریشاکلی BL21 انتقال داده شد. باکتری های حاوی ژن نوترکیب، با IPTGالقا شدند و بیان پروتئین نوترکیب با استفاده از روش SDS PAGE تایید شد. وزن مولکولی پروتئین نوترکیب موردنظر حدود 24 کیلودالتون بوده و از آن میتوان در طراحی کیت تشخیصی الایزا استفاده کرد

کلیدواژه‌ها

موضوعات


1- Lu, Z., Zhang, X., Fu, Y., Cao, Y., Tian, M., Sun, P.and Xie, Q. (2010). Expression of the major epitope regions of 2C integrated with the 3AB non-structural protein of foot-and-mouth disease virus and its potential for differentiating infected from vaccinated animals. J. Virol. Methods, 170(1-2), 128-133.
2- Dory, D., Rémond, M., Béven, V., Cariolet, R., Zientara, S., and Jestin, A. (2009). Foot-and-Mouth Disease Virus neutralizing antibodies production induced by pcDNA3 and Sindbis virus based plasmid encoding FMDV P1-2A3C3D in swine. Antivir. Res., 83(1), 45-52.
3- Clavijo, A., Wright, P., and Kitching, P. (2004). Developments in diagnostic techniques for differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease. Vet J., 167(1), 9-22.
4- Fry, E. E., Stuart, D. I., & Rowlands, D. J. (2005). The structure of foot-and-mouth disease virus. In Foot-and-Mouth Disease Virus (pp. 71-101). Springer, Berlin, Heidelberg.
5- De Diego, M., Brocchi, E., Mackay, D., and De Simone, (1997). The non-structural polyprotein 3ABC of foot-and-mouth disease virus as a diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated cattle. Arch. Virol., 142(10), 2021-2033.
6- Hohlich, B. J., Wiesmuller, K. H., Schlapp, T., Haas, B., Pfaff, E., and Saalmuller, A. (2003). Identification of foot-and-mouth disease virus-specific linear B-cell epitopes to differentiate between infected and vaccinated cattle. J. Virol., 77(16), 8633–8639.
7- Li, C., Liang, W., Liu, W., Yang, D., Wang, H., Ma, W., Zhou, G., Yu, L. (2016). Identification of a conserved linear epitope using a monoclonal antibody against non-structural protein 3B of foot-and-mouth disease virus. Arch. Virol., 161, 365–375.
8- Chung, W. B., Sorensen, K. J., Liao, P. C., Yang, P. C., and Jong, M. H. (2002). Differentiation of foot-and-mouth disease virus-infected from vaccinated pigs by enzyme-linked immunosorbent assay using nonstructural protein 3AB as the antigen and application to an eradication program. J. Clin. Microbiol., 40(8), 2843-2848.
9- O'Donnell, V. K., Boyle, D. B., Sproat, K., Fondevila, N. A., Forman, A., Schudel, A. A., and Smitsaart, E. N. (1996). Detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus using a liquid-phase blocking sandwich ELISA (LPBE) with a bioengineered 3D protein. J.Vet. Diagn. Investig., 8(2), 143-150.
10- Mahajan, S., Mohapatra, J. K., Pandey, L. K., Sharma, G. K., and Pattnaik, B. (2015). Indirect ELISA using recombinant nonstructural protein 3D to detect foot and mouth disease virus infection associated antibodies. Biologicals, 43(1), 47-54.
11- Yang, M., Clavijo, A., Li, M., Hole, K., Holland, H., Wang, H., and Deng, M. Y. (2007). Identification of a major antibody binding epitope in the non-structural protein 3D of foot-and-mouth disease virus in cattle and the development of a monoclonal antibody with diagnostic applications. J. Immunol. Methods, 321(1-2), 174-181.
12- Grazioli, S., and Brocchi, E. Mapping of immunodominant regions of the non structural protein 3D of FMDV, relevant for the recognition of an infection status. Available online at: www.fao.org/ag/againfo/commissions/docs/research_group/erice/11_poster.pdf. Accessed 12 april 2017.
13- Mohapatra, J. K., Pandey, L. K., Sanyal, A., and Pattnaik, B. (2011). Recombinant non-structural polyprotein 3AB-based serodiagnostic strategy for FMD surveillance in bovines irrespective of vaccination. J. Virol. Methods, 177(2), 184-192.
14- Carrillo, C., Tulman, E. R., Delhon, G., Lu, Z., Carreno, A., Vagnozzi, A., and Rock, D. L. (2005). Comparative genomics of foot-and-mouth disease virus. J. Virol., 79(10), 6487-6504.
15- Bergmann, I. E., Neitzert, E., Beck, E., and Gomes, I. (1993). Diagnosis of persistent aphthovirus infection and its differentiation from vaccination response in cattle by use of enzyme-linked immunoelectrotransfer blot analysis with bioengineered nonstructural viral antigens. Am. J. Vet. Res., 54(6), 825-831.
16- Neitzert, E., Beck, E. W. A. L. D., de Mello, P. A., Gomes, I., and Bergmann, I. E. (1991). Expression of the aphthovirus RNA polymerase gene in Escherichia coli and its use together with other bioengineered nonstructural antigens in detection of late persistent infections. Virology, 184(2), 799-804.
17- Kumar, R., Hosamani, M., Sreenivasa, B. P., Kotyal, A., and Venkataramanan, R. (2012). Expression of foot-and-mouth disease virus non-structural protein, 3D in insect cells and its application in detection of anti-FMDV antibodies. Indian J. Virol., 23(3), 326-332.
18- Perkins, J., Clavijo, A., Hindson, B. J., Lenhoff, R. J., and McBride, M. T. (2006). Multiplexed detection of antibodies to nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus. Anal. Chem., 78(15), 5462-5468.