کلون‌کردن ژن survivin انسانی در وکتور پروکاریوتی pET-28a و ارزیابی بیان پروتئین در باکتری E.coli BL21(DE3)

نوع مقاله : پژوهشی اصیل

نویسندگان

دانشگاه تربیت مدرس

چکیده
مهارکننده آپوپتوز (IAP) یک خانواده از پروتئین­ها هستند که با مهار فعالیت کاسپاز مرگ سلول را متوقف می­کنند. Survivin کوچکترین پروتئین شناخته شده از این خانواده است که در سلول­های سرطانی مشاهده می­شود اما در بافت­های نرمال بجز بافت جنینی مشاهده نشده است. survivin ممکن است به­عنوان یک مارکر جدید برای شناسایی و درمان سرطان مورد استفاده قرار گیرد. هدف از این پژوهش، کلونینگ ژن survivin در وکتور pET-28a و بیان پروتئین در باکتری E.coli بود.

ژن survivin با روش PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و الگوی pcDNA-survivin تکثیر شد. محصول PCR و پلاسمید pET-28a با آنزیم­های محدودگر HindIII/NheIبرش داده و survivin درون وکتور برش خورده الحاق شد. سپس محصول الحاق شده به باکتری E.coli DH5a ترنسفورم و با استفاده از آنتی بیوتیک کانامایسین غربالگری شد. کلونی­ها با روش PCR ارزیابی شده و پلاسمید کلونی مثبت با روش هضم دوگانه غربالگری شده، در نهایت یک کلونی مثبت با تعیین توالی تایید شد. پلاسمید نوترکیب با روش شیمیایی به باکتری بیانی E.coli (BL21) ترنسفورم شد. بیان survivin در شرایط مختلف انجام و سطح بیان با SDS-PAGE بررسی شد.

اندازه قطعه تکثیرشده توسط PCR با استفاده از ژل آگارز تایید شد. پلاسمید pET-28a برش خورده نیز فعالیت آنزیمی را تایید کرد. قطعه کلون شده پس از توالی­یابی تشابه 100% با survivin انسانی داشت. افزودن IPTG موجب بیان پروتئین survivin در تمام شرایط خصوصا در دمای 37 درجه سانتیگراد از زمان 2 ساعت پس از القا شد اما در تمام شرایط، عمده survivin بیان شده در باکتری به صورت تجمعی بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


[1] Berthelet J, Dubrez L. Regulation of Apoptosis by Inhibitors of Apoptosis (IAPs). Cells 2013;2:163–187.
[2] Finlay D, Teriete P, Vamos M, Cosford NDP, Vuori K. Inducing death in tumor cells: roles of the inhibitor of apoptosis proteins. F1000Res. 2017;6:587.
[3] Miller LK, An exegesis of IAPs: salvation and surprises from BIR motifs. Trends in cell biology. 1999; 9:323-328.
[4] Altieri DC, Marchisio PC. Survivin apoptosis: an interloper between cell death and cell proliferation in cancer. Lab Invest. 1999;79:1327-33.
[5] Verdecia MA, Huang H, Dutil E, Kaiser DA, Hunter T, Noel JP. Structure of the human anti-apoptotic protein survivin reveals a dimeric arrangement. Nature Structural Biology 2000;7:602-608.
[6] Chantalat L, Skoufias DA, Kleman JP, Jung B, Dideberg O, Margolis RL. Crystal structure of human survivin reveals a bow tie-shaped dimer with two unusual α-helical extensions. Molecular cell 2000;6:183-189.
[7] Mahotka C, Wenzel M, Springer E, Gabbert HE, Gerharz CD. Survivin-ΔEx3 and survivin-2B: two novel splice variants of the apoptosis inhibitor survivin with different antiapoptotic properties. Cancer Research 1999;59:6097-6102.
[8] Li F, Ling X. Survivin Study: An update of “What is the next wave?”. Journal of cellular physiology 2006;208:476-486.
[9] Dohi, T, Beltrami E, Wall NR, Plescia J, Altieri DC. Mitochondrial survivin inhibits apoptosis and promotes tumorigenesis. The Journal of clinical investigation, 2004. 114(8): p. 1117-1127.
[10] Dohi T, Beltrami E, Wall NR, Plescia J, Altieri DC. An IAP-IAP complex inhibits apoptosis. Journal of Biological Chemistry 2004;279:34087-34090.
[11] Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c–dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 2000;102:33-42.
[12] Coumar MS, Tsai FY, Kanwar JR, Sarvagalla S, Cheung CH. Treat cancers by targeting survivin: just a dream or future reality? Cancer treatment reviews 2013;39:802-811.
[13] Ma X, Zheng W, Wei D, Ma Y, Wang T, Wang J, Liu Q, Yang S. Construction, expression, and purification of HIV-TAT-survivin(T34A) mutant: a pro-apoptosis protein in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 2006;47:36-44.
[14] Zhang HY. Preparation and Evaluation of activity of Highly-soluble Anticancer Protein Drug TAT-survivin(T34A). Indian Journal of Pharmaceutical Sciences 2019;81:266-272.
[15] Tsai SL, Chang YC, Sarvagalla S, Wang S, Coumar MS, Cheung CHA. Cloning, expression, and purification of the recombinant pro-apoptotic dominantnegative survivin T34A-C84A protein in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 2019;160:73-83.
[16] De Groot NS, Ventura S. Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies. FEBS Letter 2006;580(27):6471-6476.
[17] Iljina, M, Garcia GA, Horrocks MH, Tosatto, L, Choi, ML, Ganzinger KA, et al. Kinetic model of the aggregation of alpha-synuclein provides insights into prion-like spreading. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113:E1206-1215.