تشخیص نوروتوکسین کلستریدیوم بوتولینوم تیپ B به روش ساندویچ الایزا

نوع مقاله : پژوهشی اصیل

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی پزشکی و نانوتکنولوژی ، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران.

2 دانشیار، گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه امام حسین(ع)، تهران، ایران

3 استاد ، مرکز تحقیقات بیولوژی‌مولکولی، پژوهشکده سیستم بیولوژی مسمومیت‌ها، دانشگاه علوم‌ پزشکی بقیه‌ا... (عج) ، تهران، ایران

4 کارشناسی ارشد، گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه امام حسین(ع)، تهران، ایران

5 دکتری تخصصی، گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه امام حسین(ع)، تهران، ایران

6 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه جامع امام حسین، تهران، ایران.

چکیده
زمینه و هدف: سموم بوتولینوم (BoNTs) جزء کشنده‌ترین ترکیباتی هستند که تاکنون شناخته‌شده‌ و عامل بیماری بوتولیسم می‌باشند. در حال حاضر، تشخیصBoNT در غذا به استفاده از سنجش زیستی روی موش آزمایشگاهی است که یک روش بسیار حساس (محدوده تشخیص pg mL-1 7 تا 20) اما زمان‌بر می‌باشد. این روش سریع، اختصاصی و می تواند حساسیتی معادل آزمایش روی موش آزمایشگاهی دارد. هدف از این تحقیق استفاده از روش ساندویچ الایزا جهت شناساییBoNT/B بود.

مواد و روش‌ها: پروتئین نوترکیب 370 اسید آمینه‌ای از انتهای کربوکسیل بخش اتصال‌دهنده سم BoNT/B با وزن مولکولی 45 کیلودالتون به عنوان آنتی‌ژن بیان و به روش کروماتوگرافی تمایلی Ni-NTA خالص‌سازی شد. آنتی‌بادی IgG از سرم موشی و خرگوشی با روش کروماتوگرافی تمایلی رزین پروتئین G جداسازی و به روش SDS-PAGE و آزمون الایزا ، تائیدشد. حساسیت و اختصاصیت روش طراحی‌شده جهت تشخیص آنتی‌ژن نوترکیب BoNT/B-HcC و توکسوئید بوتولینوم تایپ B ارزیابی شد.

نتایج: غلظت آنتیبادی موشی و خرگوشی تخلیص شده به ترتیب 3 و 5/4 میلی‌گرم از هر میلی‌لیتر سرم بود. حداقل غلظت پروتئین قابل شناسایی به روش الایزا غیر مستقیم با آنتی بادی تخلیص شده موشی و خرگوشی 475 و 118 پیکوگرم تعیین شد. با بهینه سازی روش ساندیچ الایزا حداقل30 نانوگرم از آنتی‌ژن نوترکیبBoNT/B-HcC و 146 پیکوگرم ازBoNT/B با اختصاصیت بالا شناسایی شد.

نتیجه‌گیری: روش ساندویچ الایزای طراحی شده می تواند برای شناسایی دقیق و حساس سم کلستردیوم بوتولینوم تیپ B مورد استفاده قرار گیرد. لازم است در آینده کارآیی این روش برای تشخیص سم بوتولینوم در نمونههای محیطی و غذایی ارزیابی گردد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


1. Simpson, L., Botulinum neurotoxin and tetanus toxin. 2012: Elsevier.
2. Smits, W.K., et al., Clostridium difficile infection. Nature reviews Disease primers, 2016. 2(1): p. 1-20.
3. Smith, T.J., K.K. Hill, and B.H. Raphael, Historical and current perspectives on Clostridium botulinum diversity. Research in Microbiology, 2015. 166(4): p. 290-302.
4. Eklund, M., et al., Bacteriophage and the toxigenicity of Clostridium botulinum type C. Science, 1971. 172(3982): p. 480-482.
5. Rossetto, O., Pirazzini, M., Lista, F., & Montecucco, C.. The role of the single interchains disulfide bond in tetanus and botulinum neurotoxins and the development of antitetanus and antibotulism drugs. Cellular Microbiology. 2019, 21(11), e13037.‏
6. Lindstrom, M. and H. Korkeala, Laboratory diagnostics of botulism. Clinical microbiology reviews, 2006. 19(2): p. 298-314.
7. Shi, D. Y., Chen, B. Y., Mao, Y. Y., Zhou, G., Lu, J. S., Yu, Y. Z., ... & Sun, Z. W. Development and evaluation of candidate subunit vaccine against botulinum neurotoxin serotype B. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 2019, 15(3), 755-760.‏
8. Moreira Jr, C., et al., Protective efficacy of recombinant bacterin vaccine against botulism in cattle. Vaccine, 2020. 38(11): p. 2519-2526.
9. Grenda, T., E. Kukier, and K. Kwiatek, Methods and difficulties in detection of Clostridium botulinum and its toxins. Polish journal of veterinary sciences, 2014. 17(1).
10. He, F., Laemmli-sds-page. Bio-protocol, 2011: p. e80-e80.
11. Kielkopf, C. L., Bauer, W., & Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harbor Protocols, 2020(4), pdb-prot102269.‏
12. He, F., Bradford protein assay. Bio-protocol, 2011: p. e45-e45.
13. Dolman, C. and L. Murakami, Clostridium botulinum type F with recent observations on other types. The Journal of Infectious Diseases, 1961: p. 107-128.
14. Janik, E., et al., Biological toxins as the potential tools for bioterrorism. International journal of molecular sciences, 2019. 20(5): p. 1181.
15. Singh, A., et al., Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit for the detection of botulinum neurotoxins A, B, E, and F in selected food matrices. Health security, 2015. 13(1): p. 37-44.
16. Saadati, M., Double Sandwich ELISA Modified Method for the Detection of Clostridium Botulinum Type E. Journal of Fasa University of Medical Sciences, 2013. 3(2): p. 136-142.
17. Stanker, L.H., et al., A monoclonal antibody based capture ELISA for botulinum neurotoxin serotype B: toxin detection in food. Toxins, 2013. 5(11): p. 2212-2226.