کلون سازی کاسپاز۹ در وکتور یوکاریوتی، بررسی بیان و سنجش عملکرد آن در سلول

نوع مقاله : پژوهشی اصیل

نویسندگان

دانشگاه تربیت مدرس

چکیده
اهداف: مرگ سلولی برنامه ریزی شده فرایند مهمی است که طی تکامل بدون تغییر باقی مانده است. این فرایند در تنظیم شرایط فیزیولوژیکی و پاتوفیزیولوژیکی موثر است. آپوپتوز شناخته شده­ترین نوع مرگ سلولی است که در بسیاری از تومورها مختل شده و سبب مقاومت به درمان می شود. کاسپاز9 یکی از پروتئین­های کلیدی مسیر میتوکندریایی آپوپتوز است. فعال شدن کاسپاز9 منجر به فعال شدن کاسپاز­های اجرایی مانند کاسپاز3/۷ شده و با راه اندازی آبشار کاسپازی منجر به مرگ سلول می­­شود. در این مطالعه، ژن کاسپاز9 در وکتور یوکاریوتی pcDNA3.1(+) کلون و عملکرد آن در سلول­ بررسی شد.

مواد و روش­ها: ژن کاسپاز9 طی PCR با پرایمر­های اختصاصی تکثیر و پس از هضم دوگانه با آنزیم­های KpnI و BamHI به پلاسمید pcDNA برش خورده الحاق شد. پلاسمید نوترکیب حاصل پس از تعیین توالی به رده سلولی SH-SY5Y ترنسفکت و با داروی دوکسوروبیسین تیمار شد. عملکرد آن بر مرگ سلولی با روش رنگ آمیزی تریپان بلو و PI، و سنجش فعالیت کاسپاز۳ بررسی و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد.

یافته ها: کلونینگ ژن کاسپاز9 انجام و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد. افزایش بیان کاسپاز۹ در سلول منجر به پردازش خود بخودی آن طی همودایمریزاسیون و در نتیجه القای مرگ سلولی شده و حساسیت سلول نسبت به دوکسوروبیسین را افزایش و زنده مانی سلولی را کاهش داد.

نتیجه گیری: ژن کاسپاز9 کلون شده در سلول فعالیت نشان داد و آپوپتوز را در حضور دوکسوروبیسین از طریق خود فعال­سازی و متعاقبا تشدید فعال­سازی کاسپاز۳ افزایش داد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


1. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer. 1972;
2. Jin Z, El-Deiry WS. Overview of cell death signaling pathways. Cancer Biology and Therapy. 2005.
3. Taylor RC, Cullen SP, Martin SJ. Apoptosis: Controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2008.
4. Häcker G. The morphology of apoptosis. Cell and Tissue Research. 2000.
5. Hongmei Z. Extrinsic and Intrinsic Apoptosis Signal Pathway Review. In: Apoptosis and Medicine. 2012.
6. Bratton SB, Walker G, Srinivasula SM, Sun XM, Butterworth M, Alnemri ES, et al. Recruitment, activation and retention of caspases-9 and-3 by Apaf-1 apoptosome and associated XIAP complexes. EMBO J. 2001;
7. Tirmomenin M, Ataei F, Hosseinkhani S. Cloning of human survivin in pET-28a and its protein expression study in E.coli BL21(DE3). Modares J Biotechnol [Internet]. 2020 Oct 10 [cited 2021 Apr 25];11(3):0–0. Available from: https://biot.modares.ac.ir/article-22-41661-en.html
8. Mehdizadeh K, Ataei F, Hosseinkhani S. Effects of doxorubicin and docetaxel on susceptibility to apoptosis in high expression level of survivin in HEK and HEK-S cell lines as in vitro models. Biochem Biophys Res Commun. 2020;
9. Mahmood T, Yang PC. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 2012;
10. Bian X, Giordano TD, Lin HJ, Solomon G, Castle VP, Opipari AW. Chemotherapy-induced Apoptosis of S-type Neuroblastoma Cells Requires Caspase-9 and Is Augmented by CD95/Fas Stimulation. J Biol Chem. 2004;
11. Mehdizadeh K, Ataei F, Hosseinkhani S. Treating MCF7 breast cancer cell with proteasome inhibitor Bortezomib restores apoptotic factors and sensitizes cell to Docetaxel. Med Oncol. 2021;
12. Silke J, Hawkins CJ, Ekert PG, Chew J, Day CL, Pakusch M, et al. The anti-apoptotic activity of XIAP is retained upon mutation of both the caspase 3- and caspase 9-interacting sites. J Cell Biol. 2002;