غربالگری و شناسایی باکتری‌های تجزیه کننده سلولز از خاک و کلون سازی ژن مربوط به آنزیم اندوگلوکاناز

نوع مقاله : پژوهشی اصیل

نویسندگان

گروه علوم جانوری، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه تبریز، تبریز

چکیده
امرزه استفاده از بیوکاتالیست‌ها در صنعت اهمیت فراوانی دارد. چون آنها واکنش‌های شیمیایی را با صرف کمترین انرژی و بالاترین بازده انجام می‌دهند. در این بین آنزیم‌های باکتریایی با توجه به روش آسان کلون‌سازی و بیان بالای پرتئین‌ها در میزبان قابل دستورزی اهمیت خاصی دارند. آنزیم سلولاز فراوانترین پلیمر موجود در طبیعت را به واحدهای گلوکز هیدرولیز می‌کند. ‌گلوکز تولید شده از این روش می‌تواند کاربردهای متنوع داشته باشد از جمله تولید سوخت زیستی، شیرین کننده در صنایع غذایی و تولید اتانول. با توجه به کاربرد گسترده این آنزیم، در سال‌های اخیر کلون‌سازی و تولید آن در میزبان‌های دستورزی شده گسترش یافته است. این مطالعه به منظور جداسازی، غربالگری و شناسایی سویه‌های بومی تولید کننده آنزیم اندوگلوکاناز از نمونه‌های خاک اطراف ریشه درخت افرا در منطقه شمال کشور انجام شد. سویه‌های جدا شده با استفاده از توالی یابی ژن 16S rRNA شناسایی شدند. پس از شناسایی نوع باکتری(Enterobacter hormaechei) ، تکثیر ژن آنزیم اندوگلوکاناز ابتدا توسط آغازگرهای دژنره و سپس توسط آغازگرهای اختصاصی دارای توالی‌های برشی انجام شد و الحاق ژن در پلاسمید مناسب با استفاده از آنزیم‌های برشی و الحاقی مناسب صورت گرفت. سپس پلاسمید نوترکیب حاصل به میزبان E.coli BL-21 ‌منتقل شد و بیان پروتئین هدف با تحریک اوپران لک در غلظت mM 1 IPTG انجام گرفت. ثابت‌های کینتیکی آنزیم از جمله Vmax و Km به ترتیب برابر با 45 میکرومول در دقیقه و 4/1 میلی‌گرم در میلی لیتر محاسبه گردید. بهینه شرایط فعالیت آنزیم نوترکیب تولید شده در دمای °C37 و pH 7 می‌باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


1. Rastogi, G., Bhalla, A., Adhikari, A., Bischoff, K. M., Hughes, S. R., Christopher, L. P., and Sani, R. K. (2010) Characterization of thermostable cellulases produced by Bacillus and Geobacillus strains. Bioresource technology. 101(22), 8798-8806.
2. Guder, D. G., and Krishna, M. S. R. (2019) Isolation and characterization of potential cellulose degrading bacteria from sheep rumen. J Pure Appl Microbiol. 13(3), 1831-1839.
3. Nevell, T. P., and Zeronian, S. H. (1985) Cellulose chemistry and its applications.
4. Helal, G. A., Khalil, R. R., Galal, Y. G., Soliman, S. M., and Abd Elkader, R. S. (2022) Studies on cellulases of some cellulose-degrading soil fungi. Archives of Microbiology. 204(1), 1-16.
5. آراسته, ا., سریری ,ر., نجفی یاسوری, ف., صالح زاده, ع., and نجفیان, م .‎ (1390) بررسی اثر سلولاز جداسازی شده از قارچ آسپرژیلوس نایجر بر کیفیت چای شمال ایران. زیست فناوری میکروبی. 3(10).
6. Guo, J. , Starr, D. and Guo, H. (2020) Classification and review of free PCR primer design software. Bioinformatics. 36(22-23), 5263-5268.
7. Marbach, A., and Bettenbrock, K. (2012) lac operon induction in Escherichia coli: Systematic comparison of IPTG and TMG induction and influence of the transacetylase LacA. Journal of biotechnology. 157(1), 82-88.
8. عصاره, ر., شهبانی ظهیری, ح. , عشقی ,س. (2014) جداسازی و شناسایی باکتریهای بومی تجزیه کننده سلولز از خاک. پژوهش‌های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). 27(1),99-110.
9. رجب خانی, ز., زمانی, م,. مطلبی, م,. and عنصری, د. (1388) بهینه سازی تولید آنزیم بتا 1 و 4 اندوگلوکاناز (سلولاز) قارچ ( Aspergillus niger (R4 و همسانه سازی ژن eglB. زیست شناسی ایران. 22(4).
10. Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., and Gulati, A. (2008) A rapid and easy method for the detection of microbial cellulases on agar plates using Gram’s iodine. Current microbiology. 57(5), 503-507.
11. Green, M.R. and Sambrook, J. (2021) Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. 2021(11), pdb. top101170.
12. Thomas, L., Ram, H. and Singh, V.P. (2018) Inducible cellulase production from an organic solvent tolerant Bacillus sp. SV1 and evolutionary divergence of endoglucanase in different species of the genus Bacillus. brazilian journal of microbiology. 49, 429-442.
13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual (No. Ed. 2). Cold spring harbor laboratory press.
14. Yakhchali, B. (2020) Isolation, molecular identification and optimization of amylase production of marine actinomycete (Acx1) from Shadegan estuary. Cellular and Molecular Researches (Iranian Journal of Biology). 32(4), 591-605.
15. Amin, Y.K. (2021) Single-nucleotide polymorphisms in MTHFR gene related to recurrent abortion. Applied Nanoscience. 1-7.
16. Langeveld, S. A., Dore, J. M., Memelink, J., Derks, A. F., van der Vlugt, C. I., Asjes, C. J., and Bol, J. F. (1991) Identification of potyviruses using the polymerase chain reaction with degenerate primers. Journal of General Virology. 72(7), 1531-1541.
17. Aslanidis, C., and De Jong, P. J. (1990) Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic acids research. 18(20), 6069-6074.
18. Eskandari, V. (2020) An improved method for induction of competency in Escherichia coli DH5α. Archives of Pharmacy Practice. 1, 23.
19. Manns, J.M. (2011) SDS‐polyacrylamide gel electrophoresis (SDS‐PAGE) of proteins. Current protocols in microbiology. 22(1), A. 3M. 1-A. 3M. 13.
20. Deshavath, N. N., Mukherjee, G., Goud, V. V., Veeranki, V. D., and Sastri, C. V. (2020) Pitfalls in the 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay for the reducing sugars: Interference of furfural and 5-hydroxymethylfurfural. International journal of biological macromolecules. 156, 180-185.
21. Reddy, A. R., Venkateswarulu, T. C., Babu, D. J., and Indira, M. (2015) Homology Modeling Studies of Human Genome Receptor Using Modeller, Swiss-Model Server and Esypred-3D Tools. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. (1), 1-6.
22. Lin, L., Kan, X., Yan, H., and Wang, D. (2012) Characterization of extracellular cellulose-degrading enzymes from Bacillus thuringiensis strains. Electronic Journal of Biotechnology. 15(3), 2-2.
23. Park, J. W., Park, K., Song, H., and Shin, H. (2002) Saccharification and adsorption characteristics of modified cellulases with hydrophilic/hydrophobic copolymers. Journal of biotechnology. 93(3), 203-208.
24. Ladeira, S. A., Cruz, E., Delatorre, A. B., Barbosa, J. B., and Leal Martins, M. L. (2015) Cellulase production by thermophilic Bacillus sp: SMIA-2 and its detergent compatibility. Electronic journal of biotechnology. 18(2), 110-115.
25. پاست, س,. ناظمی, ع., خاتمی نژاد, م., میری نرگسی, م., موسوی, س, .صالحی, آ. (1391) جداسازی و شناسایی ملکولی سویه های باسیلوس تولید کننده سلولاز از خاک جنگل. مجله علمی- پژوهشی زیست فناوری میکروبی دانشگاه آزاد اسلامی .4(12) ,6-1.
26. Singh, R., Kumar, R., Bishnoi, K., & Bishnoi, N. R. (2009) Optimization of synergistic parameters for thermostable cellulase activity of Aspergillus heteromorphus using response surface methodology. Biochemical Engineering Journal. 48(1), 28-35.
27. اکبریان, م., پاژنگ, م., امانی قدیم,ع., یونسی,ف. (2016). بهینه سازی فعالیت آنزیم اندوگلوکاناز Cel9A از باکتری آلیسیکلوباسیلوس اسیدوکالداریوس با روش رویه پاسخ (RSM). زیست‌فناوری, 7(1), 70-80.‎