بیان نوترکیب پپتید آمیلوئید بتای 42-1 (Aβ1-42) در سیستم باکتریایی Escherichia coli

نوع مقاله : پژوهشی اصیل

نویسندگان

1 گروه ژنتیک مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس

2 گروه زیست فناوری سامانه ای، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک

3 گروه بیوشیمی بالینی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس

چکیده
مقدمه: پپتید آمیلوئید ‌بتا () علت اصلی تشکیل پلاگ‌های سمی در بیماران آلزایمری می‌باشد. به‌همین علت، مطالعه بر روی این پپتید و شناخت مکانیسم‌های مولکولی و سلولی مرتبط آن، در تشخیص و درمان بیماری ضروری است. پژوهش حاضر یک روش سریع، آسان و ارزان برای تولید و خالص‌سازی این پپتید ارائه داده که بر اساس بیان ژن در سیستم باکتریایی است.

مواد و روش‌ها: ژن سنتز و به وکتور بیانی pET26b انتقال یافت. پس‌از القا با لاکتوز و انکوباسیون 24‌ساعته جهت بیان پپتید، رسوب سلولی حاصل به منظور بررسی و تایید وجود پپتید نوترکیب بوسیله SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی گردید. سپس خالص‌سازی پپتید نوترکیب با روش کروماتوگرافی تمایلی ستون Ni-NTA صورت گرفت. تعیین ویژگی کشندگی سلولی خالص، در غلظت های µM 25 و µM 50 با استفاده از آزمون MTT بر روی لاین سلولی مدل آلزایمر(SH-SY5Y) انجام شد.

نتایج: نتایج PCR Colony و تعیین‌توالی تاییدکننده ورود صحیح قطعه بیان‌کننده به داخل وکتور بیانی می باشد. بررسی طول باندها در SDS PAGE و وسترن بلات، نمایانگر بیان موفقیت‌آمیز پپتید نوترکیب حاوی دنباله هیستیدینی می‌باشد. در نهایت نتیجه آزمون MTT نشان داد که پپتید خالص‌شده در غلظت‌های µM25 و µM50 به‌ترتیب دارای کشندگی 30 و 50 درصدی است.

بحث: تولید پپتید آمیلوئید ‌بتا در میزبان‌های باکتریایی بسیار مطلوب به‌نظر می‌رسد. همچنین به‌دست‌آوردن پپتید خالص به صورت محلول یک مزیت مهم این تحقیق می‌باشد. با توجه به عملکرد کشندگی پپتید خالص‌شده، میتوان از آن برای تیمار سلول‌های مدل و انجام مطالعات پیرامون آلزایمر استفاده نمود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


1. Hamley, I.W., The amyloid beta peptide: a chemist’s perspective. Role in Alzheimer’s and fibrillization. Chemical reviews, 2012. 112(10): p. 5147-5192.
2. Murphy, M.P. and H. LeVine III, Alzheimer's disease and the amyloid-β peptide. Journal of Alzheimer's disease, 2010. 19(1): p. 311-323.
3. Ballard, C., et al., Alzheimer's disease. the Lancet, 2011. 377(9770): p. 1019-1031.
4. Jia, L., et al., Highly efficient soluble expression, purification and characterization of recombinant Aβ42 from Escherichia coli. RSC advances, 2018. 8(33): p. 18434-18441.
5. Prakash, P., et al., Rapid, refined, and robust method for expression, purification, and characterization of recombinant human amyloid beta 1-42. Methods and Protocols, 2019. 2(2): p. 48.
6. Tickler, A.K., A.B. Clippingdale, and J.D. Wade, Amyloid-β as a “difficult sequence” in solid phase peptide synthesis. Protein and peptide letters, 2004. 11(4): p. 377-384.
7. Finder, V.H., et al., The recombinant amyloid-β peptide Aβ1–42 aggregates faster and is more neurotoxic than synthetic Aβ1–42. Journal of molecular biology, 2010. 396(1): p. 9-18.
8. Jia, L., et al., Expression and purification of amyloid β-protein, tau, and α-synuclein in Escherichia coli: a review. Critical reviews in biotechnology, 2020. 40(4): p. 475-489.
9. Garai, K., et al., Expression and purification of amyloid-beta peptides from Escherichia coli. Protein Expr Purif, 2009. 66(1): p. 107-12.
10. Dahlgren, K.N., et al., Oligomeric and fibrillar species of amyloid-β peptides differentially affect neuronal viability. Journal of Biological Chemistry, 2002. 277(35): p. 32046-32053.
11. Ying, Z., et al., Preparation and Characterization of a Monoclonal Antibody with High Affinity for Soluble Aβ Oligomers. Hybridoma, 2009. 28(5): p. 349-354.
12. Ryan, D.A., et al., An improved method for generating consistent soluble amyloid-beta oligomer preparations for in vitro neurotoxicity studies. Journal of neuroscience methods, 2010. 190(2): p. 171-179.
13. Chhetri, G., et al., An improved method for high-level soluble expression and purification of recombinant amyloid-beta peptide for in vitro studies. Protein Expression and Purification, 2015. 114: p. 71-76.
14. Garai, K., et al., Expression and purification of amyloid-β peptides from Escherichia coli. Protein expression and purification, 2009. 66(1): p. 107-112.
15. Stephens, A.D., et al., Fast purification of recombinant monomeric amyloid-β from E. coli and amyloid-β-mCherry aggregates from mammalian cells. ACS Chemical Neuroscience, 2020. 11(20): p. 3204-3213.
16. Walsh, D.M., et al., A facile method for expression and purification of the Alzheimer’s disease‐associated amyloid β‐peptide. The FEBS journal, 2009. 276(5): p. 1266-1281.
17. Caine, J.M., et al., Oligomerization and toxicity of Aβ fusion proteins. Biochemical and biophysical research communications, 2011. 409(3): p. 477-482.
18. Jia, L., et al., Amyloidogenicity and Cytotoxicity of a Recombinant C-Terminal His6-Tagged Aβ1–42. ACS Chemical Neuroscience, 2018. 10(3): p. 1251-1262.
19. Liao, Y.-H. and Y.-R. Chen, A novel method for expression and purification of authentic amyloid-β with and without 15N labels. Protein expression and purification, 2015. 113: p. 63-71.
20. Long, F., W. Cho, and Y. Ishii, Expression and purification of 15N-and 13C-isotope labeled 40-residue human Alzheimer’s β-amyloid peptide for NMR-based structural analysis. Protein expression and purification, 2011. 79(1): p. 16-24.
21. Gopal, G.J. and A. Kumar, Strategies for the production of recombinant protein in Escherichia coli. The protein journal, 2013. 32: p. 419-425.
22. Vosough, F. and A. Barth, Characterization of homogeneous and heterogeneous amyloid-β42 oligomer preparations with biochemical methods and infrared spectroscopy reveals a correlation between infrared spectrum and oligomer size. ACS Chemical Neuroscience, 2021. 12(3): p. 473-488.
23. Pujol-Pina, R., et al., SDS-PAGE analysis of Aβ oligomers is disserving research into Alzheimer s disease: appealing for ESI-IM-MS. Scientific reports, 2015. 5(1): p. 14809.
24. Kim, E.-K., et al., Large-scale production of soluble recombinant amyloid-β peptide 1–42 using cold-inducible expression system. Protein expression and purification, 2012. 86(1): p. 53-57.
25. Hiroaki, H., Molecular mechanisms of amyloid-β peptide fibril and oligomer formation: NMR-based challenges. Biophysics and Physicobiology, 2023. 20(1).
26. Stine, W.B., et al., Preparing synthetic Aβ in different aggregation states. Methods Mol Biol, 2011. 670: p. 13-32.
27. Shobo, A., et al., Biophysical characterization as a tool to predict amyloidogenic and toxic properties of amyloid‐β42 peptides. FEBS letters, 2022. 596(11): p. 1401-1411.
28. Zhang, H., et al., Cellular response to β-amyloid neurotoxicity in Alzheimer's disease and implications in new therapeutics. Animal Model Exp Med, 2023. 6(1): p. 3-9.
29. Leong, Y.Q., et al., Mechanisms of action of amyloid-beta and its precursor protein in neuronal cell death. Metab Brain Dis, 2020. 35(1): p. 11-30.
30. Kronqvist, N., et al., Efficient protein production inspired by how spiders make silk. Nature communications, 2017. 8(1): p. 15504.
31. Satakarni, M. and R. Curtis, Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein expression and purification, 2011. 78(2): p. 113-119.