زیست فناوری

چکیده علی‌رغم مزیت‌های بیوسورفاکتانت‌ها در مقابل سورفاکتانت‌های شیمیایی، بدلیل هزینه‌های بالای تولید استفاده گسترده از بیوسورفاکتانت‌ها محدود شده است. استفاده مواد اولیه ارزان‌قیمت مانند محصولات جانبی و ضایعات کارخانجات و صنایع مختلف ممکن است تا حد زیادی باعث کاهش هزینه‌های تولید گردد. با توجه به تنوع و فراوانی مختلف این مواد در کشور‌های متفاوت مواد اولیه استفاده شده متنوع می‌باشد. در ایران علاوه بر ترکیبات هیدروکربنی، ملاس نیز از عمده‌ترین محصولات جانبی به شمار می‌رود. در این مطالعه از میان 16 باکتری تجزیه کننده نفت با تکنیک‌های مقدماتی تشخیص تولید کننده‌های بیوسورفاکتانت، سویه Pseudomonas aeruginosa ZN به عنوان کاراترین سویه شناسایی شد. برای تعیین بهترین غلظت ملاس برای رشد باکتری و تولید بیوسورفاکتانت غلظت‌های 2-12 درصد (v/v) بکار گرفته شد. باکتری قادر به رشد و تولید بیوسورفاکتانت در تمام غلظت‌های تست شده بود اما بیشترین میزان رشد و تولید در غلظت‌های 4-6 درصد (v/v) مشاهده شد. هم‌چنین در غلظت بهینه ملاس قادر به کاهش کشش سطحی از 70 تا مقدار 32-34 میلی‌نیوتن/ متر بوده است. غلظت‌های بالاتر از 6 درصد اثر مهاری برروی رشد باکتری و تولید بیوسورفاکتانت دارد. برای شناسایی نسبی بیوسورفاکتانت تولید شده عملیات بازیابی با روش‌های رسوب‌دهی با اسید و استخراج با حلال (اتیل استات: هگزان) صورت گرفت و روش‌های مختلف رنگ آمیزی کاغذهای TLC و مایع‌های رویی محیط کشت فاقد باکتری نشان داد که دو بیوسورفاکتانت تولیده شده از جنس گلیکولیپید می‌باشند.

چکیده مهارکننده آپوپتوز (IAP) یک خانواده از پروتئین­ها هستند که با مهار فعالیت کاسپاز مرگ سلول را متوقف می­کنند. Survivin کوچکترین پروتئین شناخته شده از این خانواده است که در سلول­های سرطانی مشاهده می­شود اما در بافت­های نرمال بجز بافت جنینی مشاهده نشده است. survivin ممکن است به­عنوان یک مارکر جدید برای شناسایی و درمان سرطان مورد استفاده قرار گیرد. هدف از این پژوهش، کلونینگ ژن survivin در وکتور pET-28a و بیان پروتئین در باکتری E.coli بود.
ژن survivin با روش PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و الگوی pcDNA-survivin تکثیر شد. محصول PCR و پلاسمید pET-28a با آنزیم­های محدودگر HindIII/NheIبرش داده و survivin درون وکتور برش خورده الحاق شد. سپس محصول الحاق شده به باکتری E.coli DH5a ترنسفورم و با استفاده از آنتی بیوتیک کانامایسین غربالگری شد. کلونی­ها با روش PCR ارزیابی شده و پلاسمید کلونی مثبت با روش هضم دوگانه غربالگری شده، در نهایت یک کلونی مثبت با تعیین توالی تایید شد. پلاسمید نوترکیب با روش شیمیایی به باکتری بیانی E.coli (BL21) ترنسفورم شد. بیان survivin در شرایط مختلف انجام و سطح بیان با SDS-PAGE بررسی شد.
اندازه قطعه تکثیرشده توسط PCR با استفاده از ژل آگارز تایید شد. پلاسمید pET-28a برش خورده نیز فعالیت آنزیمی را تایید کرد. قطعه کلون شده پس از توالی­یابی تشابه 100% با survivin انسانی داشت. افزودن IPTG موجب بیان پروتئین survivin در تمام شرایط خصوصا در دمای 37 درجه سانتیگراد از زمان 2 ساعت پس از القا شد اما در تمام شرایط، عمده survivin بیان شده در باکتری به صورت تجمعی بود.

چکیده فیبرینوژن یکی از اجزای اصلی آبشار انعقادی است و به دنبال آسیب بافت، به سرعت، داربست نامحلول فیبرینی را تشکیل می دهد. فیبرین یک زیست پلیمر رشته‌ای است که به طور طبیعی در هنگام لخته شدن خون از پلیمریزاسیون فیبرینوژن تشکیل می شود. پس از آسیب‌های بافتی و شروع آبشار انعقادی، پلیمریزاسیون فیبرینوژن محلول توسط آنزیم ترومبین در یک شبکه فیبرین نامحلول آغاز و با همراهی پلاکت ها، لخته خون را تشکیل می دهند. این شبکه فیبرین برای ایجاد هموستاز پس از آسیب بافتی بسیار حایز اهمیت است. این زیست‌ پلیمر بدن همچنین به عنوان یک داربست موقت در ترمیم زخم نقش اصلی را ایفا می کندوبه دلیل ویژگی ساختاری و عملکرد فیزیولوژیک منحصربفرد خود، در پزشکی بازساختی مورد استفاده قرار میگیرد. فیبرین قادر به انتقال پروتئین های ماتریس خارج سلولی (ECM)مانند فیبرونکتین و فاکتورهای رشد است. از انواع داربست های اصلی فیبرینی مانند فیبرین غنی از پلاکت (PRF)و پلاسمای غنی از پلاکت (PRP)به عنوان زیست مواد اتولوگ در پزشکی بازساختی، ترمیم زخم، ارتوپدی و درمان‌های بازسازی و زیبایی پوست مورد استفاده قرار می‌گیرند. مشتقات و محصولات تخریب فیبرین نیز با تحریک نفوذ سلول ها و بازسازی بافت، نقش مهمی در روند ترمیم زخم ایفا می کنند و آنها به طور گسترده به عنوان ماده بیولوژیکی در توسعه محصولات جدید برای بیش از یک قرن مورد استفاده قرار گرفته اند.

چکیده گلوکوآمیلاز یک آنزیم مهم اقتصادی به دلیل توانایی‌اش درهیدرولیز نشاسته و پلیمرهای بتا دی‌گلوکز است. درک عوامل مؤثر در گرمادوستی یا سرمادوستی آنزیم گلوکوآمیلاز درتولیدایزوآنزیم‌هایی با مقاومت گرمایی یا سرمایی بالا ضروری است. دراین پژوهش، اثر دما روی تغییرات ساختاری هریک از ایزوآنزیم‌های گلوکوآمیلاز معتدل دوست، گرمادوست و سرمادوست بوسیله روش شبیه‌سازی دینامیک مولکولی بررسی شد. درکل ۲۴۰ نانوثانیه شبیه‌سازی برای سه ایزوآنزیم گلوکوآمیلاز در چهار دمای ۳۰۰، ۳۵۰، ۴۰۰ و ۴۵۰ کلوین انجام گرفت. تغییرات پارامترهای ساختاری در هرسه ایزوآنزیم مقایسه شد و مشخص گردید که از بین عوامل قابل محاسبه در شبیه‌سازی دینامیک مولکولی، انرژی الکتروستاتیک پروتئین با آب، انرژی واندروالسی بین پروتئین و آب، انرژی آزاد حلالیت(∆G_solvation)، پارامترناپایداری، سطح دردسترس حلال غیرقطبی و سطح دردسترس کل بهترو دقیق‌تر می‌توانند برای پیشگویی تغییرات پایداری گرمایی یک پروتئین در اثر افزایش دما به‌وسیله شبیه‌سازی دینامیک مولکولی استفاده شوند.

چکیده آترواسکلروز یک بیماری عروقی مزمن و عامل اصلی مرگ و میر در سراسر جهان می­باشد. اختلال در عملکرد سلول­های اندوتلیال عامل مهمی در ایجاد آترواسکلروزیز می­باشد. افزایش بیان ژن­های شاخص چسبندگی سلولی و کاهش پروتئین­های متصل کننده سلول­ها منجر به عملکرد غیرطبیعی اندوتلیوم می­شود. این تغییرات مولکولی از مهمترین نشانگرهای اختلال در سلول­های اندوتلیال و پیشرفت بیماری آترواسکلروز می­باشد. CXCR3 یک گیرنده کموکاینی G پروتئینی است که توسط سلول­های اندوتلیال بیان می­شود. نقش گیرنده CXCR3 و لیگاندهایش در عملکرد سلول­های اندوتلیالی و ایجاد بیماری­های قلبی هنوز به درستی شناخته نشده است. در این مطالعه تأثیر کاهش بیان ژن CXCR3 بر میزان بیان نشانگرهای چسبندگی (I-CAM-1 ، V-CAM-1) و اتصال محکم (TJP1) بین سلولی مورد بررسی قرار گرفت.
به منظور کاهش بیان ژن CXCR3 از DNAzyme برش دهنده بر علیه mRNA ژن CXCR3 استفاده شد. DNAzyme توسط توربوفکت به درون سلول­های HUVEC ترانسفکت شد. بعد از تایید کاهش بیان ژن CXCR3، استخراج RNA و سنتز CDNA انجام شد و سپس بیان ترانسکریپت ژن­های هدف توسط تکنیک RT-qPCR مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج بدست آمده نشان داد که سطح بیان ICAM-1 وVCAM-1 به طور قابل توجهی در سلول­های ترانسفکت شده در مقایسه با سلول­های کنترل افزایش یافت در حالی که ژن TJP1 تغییر قابل توجهی نشان نداد. به نظر می­رسد که کاهش بیان ژن CXCR3 می­تواند زمینه ساز ایجاد اختلال در عملکرد سلول­های اندوتلیالی از طریق افزایش بیان مولکول­های چسبندگی شود. بنابراین، این گیرنده می­تواند به عنوان یک هدف مولکولی بالقوه برای درک بهتری از مکانیسم ایجاد بیماری آترواسکلروز در نظر گرفته­شود.

چکیده اتوجه به شکل گیری و تکامل حیات در کنار میدان های مغناطیسی استاتیک ،مواجهه دائمی توانایی سازش را به موجودات داده است .مغناطیس درمانی از شاخه های طب مکمل محسوب می شود ،که با استفاده از میدان های مغناطیسی با شدت پایین و غیر مضر به بدن صورت می گیرد. با مطالعه بر روی زوج های نابارور،20درصد عامل مردانه، تنها علت ناباروری است ودر 50درصد موارد به عنوان یکی از عوامل مداخله کننده محسوب می شود. یکی از عوامل تاثیر گذار مربوط به ناباروری در مردان مربوط به اسپرم است . در تحقیق حاضر ،نمونه های نرمال تحت میدان مغناطیسی در شدت های 6،1 و12 میلی تسلا و در بازه های زمانی 3،1 و5 ساعت قرارگرفتند . بررسی های میزان حرکت اسپرم توسط نرم افزارکاسا وهمچنین میزان زندمانی اسپرم ها توسط رنگ آمیزی ائوزین نکروزین ونیز مورفولوژی توسط رنگ آمیزی پاپانیکولا انجام گرفت .نتایج این مرحله بر روی اسپرم های نرمال نشان دهنده ینتایج نشان دهنده تاثیر میدان مغناطیسی برحرکت اسپرم های تحت تاثیر میدان است و کاهش معناداری در حرکت اسپرم هایی که تحت اثر میدان نبودند مشاهده شد .همچنین بررسی های مورفولوژی نشان دهنده عدم تاثیر میدان مغناطیسی بر مورفولوژی اسپرم است .در آزمایش ها ی زنده مانی ،اسپرم هایی که تحت اثر میدان مغناطیسی نبودند باکاهش معناداری همراه بود ونیز مورفولوژی اسپرم بدون تغییر است.

چکیده هایپرگلیکوزیلاسیون فرایندی است که در آن با استفاده از روشهای مهندسی ژنتیک و جهش ­زایی هدفمند یک جایگاه جدید N-گلیکوزیلاسیون (موتیف Asn-Xxx-Ser/Thr) به درون توالی اسیدآمینه ­ای پروتئین نوترکیب وارد می­ شود. در صورت اتصال گلیکن جدید به آسپاراژین موجود در این موتیف، هایپرگلیکوزیلاسیون رخ می­ دهد. این فرایند بویژه در صنعت تولید پروتئین­های دارویی بسیار مورد توجه است. ویژگی­های فارماکوکینتیکی داروهای نوترکیب، ممکن است تحت تاثیر گلیکن اضافه شده قرار ­گرفته و نیمه عمر آنها افزایش یابد. در این تحقیق، بر اساس مطالعات بیوانفورماتیکی، در دامنه گلای فاکتور 9 انسانی یک جایگاه جدید N-گلیکوزیلاسیون از طریق جهش­ زایی هدفمند مبتنی بر PCR و تبدیل کدون اسیدآمینه آرژینین شماره 37 به آسپاراژین ایجاد شد. توالی رمز کنندۀ فرم جهش یافته فاکتور 9 انسانی بطور موازی با توالی طبیعی (به عنوان کنترل)، در وکتور بیانی pCEP4 مجهز به پروموتر ویروس سایتومگالو (CMV)، همسانه سازی شده و بیان آنها در سلول­های HEK293 مورد بررسی قرار گرفت. به منظور بررسی رخداد هایپرگلیکوزیلاسیون در نوع جهش یافته، از روش گرادیان SDS-PAGE دارای شیب غلظت آکریل­آمید و به دنبال آن وسترن بلاتینگ استفاده شد که نشان دهنده سنگین­تر بودن محصول جهش یافته نسبت به فرم طبیعی بود. همچنین پس از هضم با استفاده از آنزیم PNGase هر دو محصول طبیعی و جهش یافته وزن مولکولی یکسانی کسب کردند. این نتایج نشان داد که افزایش وزن مولکولی پروتئین جهش یافته ناشی از اضافه شدن گلیکن جدید بوده و تایید کننده رخداد هایپرگلیکوزیلاسیون است.

چکیده در این تحقیق، ابتدا ساختار سه داروی رایج ضد سرطان شامل 6-تیو‌گوانین (6-TG)، هیدروکسی اوره (NH) و بوسولفان با استفاده از محاسبات کوانتومی بهینه و انرژی ساختار بهینه شده به دست آمد، همچنین بهینه سازی ساختار نانوذره طلا نیز مورد بررسی قرار گرفته است. در نهایت به منظور بررسی چگونگی برهم‌کنش داروها با نانوذره، مکان های مختلف برهم کنش دارو با نانو ذره محاسبه شد و پایدارترین ساختار به منظور مطالعه بیشتر انتخاب شد. این محاسبات با استفاده از FHI-aims، که یک بسته نرم افزاری بر پایه نظریه تابعی چگالی توسعه یافته است، انجام شده‌اند. طول پیوند و بهترین انرژی برهم‌کنش در این پژوهش گزارش شده است. به منظور بررسی بهتر مکان برهم‌کنش ، نوع اوربیتا‌‌ل‌های درگیر و شکل آنها نیز نشان داده شده است. بررسی انرژی گاف نشان داد کمترین انرژی مربوط به کمپلکس نانو‌ذره طلا با داروی 6-تیوگوانین است که تایید کننده پایداری شیمیایی این دارو با نانو‌ذره است. بررسی‌ها نشان داد که انرژی اتصال نانو‌ذره طلا با داروها به ترتیب بوسولفان، هیدروکسی اوره ، 6-تیوگوانین است. سپس دارو و نانو‌ذره طلا در پایدارترین حالت ممکن ، به‌صورت تک‌تک با نرم افزار Hex 8 به سرم آلبومین انسانی به عنوان گیرنده، داک شدند و در نهایت انرژی‌های اتصالی و سایر برهم کنش ها از جمله انرژی‌های الکترواستاتیک، واندروالسی و پیوندهای هیدروژنی بین سرم آلبومین انسانی و داروها به همراه نانو‌ذره طلا محاسبه شدند. مشخص شد که جایگاه فعال داک شده برای دو دارو بوسولفان و 6-تیوگوانین یکسان است و برای داروی هیدروکسی اوره متفاوت است.

چکیده آلفا 1-آنتی‌تریپسین یک گلیکوپروتئین متشکل از 394 آمینواسید با وزن 52 کیلودالتون می‌باشد. این پروتئین به طور عمده توسط سلول‌های هپاتوسیت سنتز و به بافت‌های ریوی ترشح می‌شود و نقش اساسی در حفاظت بافت ریه در مقابل اثر نوتروفیل الاستاز دارد. از چالش‌های عمده در مواجهه با آلفا 1-آنتی‌تریپسین، ناپایداری ساختاری فرم تا خورده این پروتئین و در نتیجه تجمع آن به صورت پلیمرهای غیرفعال در بافت ریه می‌باشد. این امر فرد را مستعد ابتلا به بیماری‌های مزمن ریوی، آسم شدید و آمفیزم می‌نماید. یکی از درمان‌های رایج برای این اختلال، تزریق داخل وریدی آلفا 1-آنتی‌تریپسین می‌باشد. از طرفی، بیماران کاندید دریافت آلفا 1-آنتی‌تریپسین، دارای علائم اختلال تنفسی هستند و استفاده از بازکننده‌های برونش (سالبوتامول) خط اول درمان محسوب می‌شود. در این مطالعه تخلیص پروتئین توسط روش کروماتوگرافی تمایلی انجام و خلوص آن توسط روش ژل الکتروفورز تأیید شده است. اثر غلظت‌های مختلف سالبوتامول بر پلیمریزاسیون آلفا 1-آنتی‌تریپسین القاء شده توسط حرارت در دمای 60 درجه با روش‌های الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید غیر دناتوره کننده، پراکندگی دینامیکی نور و دو رنگ نمایی دورانی مورد سنجش قرار گرفته است. فعالیت پروتئین توسط روش تعیین ظرفیت مهاری تریپسین بررسی شده است. نتایج نشان می‌دهند که سالبوتامول با کاهش انعطاف‌پذیری حلقه مرکزی واکنش‌گر، سبب کاهش سرعت پلیمریزاسیون و در نتیجه کاهش سرعت از دست رفتن فعالیت در پروتئین آلفا 1-آنتی‌تریپسین می‌شود. بنابراین، این افزودنی می‌تواند گزینه مناسبی برای همراهی پروتئین آلفا 1-آنتی‌تریپسین و راهکاری مناسب برای درمان بیماری‌های وابسته به پلیمریزاسیون این پروتئین باشد.

چکیده بیوسورفکتانت­ها متابولیت­های تولید شده توسط میکروارگانیسم­ها هستند که به دلیل دارا بودن ویژگی­های سودمند فراوان، از قابلیت­های بالقوه و کاربردی گسترده­ای در صنایع مختلف برخوردار می­باشند. علی­رغم مزایای بسیار، به دلایل فنی و اقتصادی از جمله راندمان پایین، هزینه بالای تولید و فرآوری، و نوع سویه­های تولید­کننده، استفاده تجاری از بیوسورفکتانت­ها به­ویژه در صنایع غذایی و دارویی محدود می­باشد. اکثر میکروارگانیسم­های تولید­کننده­ی بیوسورفکتانت­ها که تاکنون مورد بررسی قرار گرفته­اند، سویه­هایی بیماری­زا بوده که کاربرد بیوسورفکتانت خام حاصل از آن­ها در مصارف صنعتی و زیست­محیطی به­ویژه در صنایع غذایی، دارویی، آرایشی و بهداشتی براحتی قابل پذیرش نخواهد بود. از این­رو، مطالعه حاضر با هدف ارزیابی و تولید حداکثری بیوسورفکتانت متصل به سلول توسط لاکتیک­اسید­باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم (ATCC 8014) از طریق تغییر و بهینه­سازی میزان منبع کربنی اصلی محیط کشت میکروبی اختصاصی انجام گرفته است. بدین منظور، سه ترکیب محیط کشت با میزان گلوکز متفاوت، از نظر تولید توده­ی سلولی و بیوسورفکتانت در فلاسک­های هم­خورنده و همچنین در بیوراکتور غیرمداوم (تحت شرایط دما، pH و سرعت همزدن کنترل­شده) مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج حاصل از تخمیر هم در آزمایشات مربوط به فلاسک­ها و هم در بیوراکتور، نشان­دهنده­ی حداکثر غلظت توده­ی سلولی (92/3 و 17/4 گرم بر لیتر) و حداقل کشش سطحی (17/41 و 48/40 میلی­نیوتن بر متر) و در نتیجه حداکثر میزان بیوسورفکتانت تولیدی در محیط کشت حاوی 30 گرم بر لیتر گلوکز می­باشند. همچنین، طیف سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز نشان داد که بیوسورفکتانت تولید شده مخلوطی از پروتئین، پلی­ساکارید و احتمالاً گروه فسفات می­باشد و دارای ساختار گلیکوپروتئینی است.