---

پروتئین اکتیوینA متشکل از دو دایمر βA بصورت یک پری-پرو-پروتئین با طول ۴۲۶ آمینواسید سنتز می شود که پس ازحذف بخشهای پری و پرو، پروتئین بالغ با طول ۱۱۶ آمینواسید حاصل می‌شود. این پروتئین که اولین بار از مایع فولیکولی گوسفند بعنوان یک محرک قدرتمند برای تولید هورمون FSH جداسازی شد، دارای عملکردهای گوناگونی مثل حفظ و بقای سلول های عصبی، آپوپتوز، رشد و تمایز در انسان می باشد. از آنجاییکه پروتئین اکتیوینA دارای کاربردهای متعددی در زمینه پزشکی مانند تمایز سلول های بنیادی، ترمیم زخم، درمان بیماری های تحلیل عصبی مانند آلزایمر و ...است برای اولین‏بار در این تحقیق در سه سویه‏ی متفاوت باکتری E.coli بیان شد. از آنجاییکه پروتئین مذکور در ساختار فعال و عملکردی خود دارای پیوندهای دی‏سولفیدی است، محیط احیا کننده‏ی سیتوپلاسم E.coli برای بیان آن مناسب نمی‌باشد لذا، محیط اکسید کننده‌ی پری‏پلاسم جهت تولید آن همراه با تاخوردگی صحیح مورد توجه قرار گرفت. در این تحقیق، cDNA ژن اکتیوین A انسانی بدست آمده از بانک اطلاعاتی NCBI پس از بهینه‌سازی رمزه به همراه پپتید نشانه تغییریافته آنزیم آلفا آمیلاز باکتری باسیلوس لیکنی فورمیس بومی ‌ایران در وکتور بیانی pET۲۱b(+)، ساب کون و سپس به روش ترنسفورماسیون به سویه‌های BL۲۱(DE۳)pLysS ،BL۲۱(DE۳)Rosetta gami و BL۲۱(DE۳) انتقال یافت. پس از بیان همزمان با استفاده از القاگر IPTG ، محتوای پروتئینی استخراج شده از هر سه سویه‏ با استفاده از تکنیکهای SDS-PAGE ، دات بلات و وسترن بلات با یکدیگر مقایسه گردید. نتایج نشان دهنده بیان در هر سه سویه باکتریایی بویژه در Rosetta gamiو DE۳ می باشد.

---

هدف: در بیان عامل تحریک کننده رده گرانولوسیت- ماکروفاژ انسانی (hGM-CSF)، در اشریشیاکلی تحت القای حرارتی، بر پایه پلاسمید pBC(SK)، که اختلاف آنها در حضور یا عدم حضور توالی خاتمه دهنده نسخه برداری در پایین دست توالی کدکننده است پروتئین نوترکیب، ساخته شد. مواد و روش ها: دو پلاسمید بیان کننده حاوی یک قطعه ۷۵ جفت بازی از پروموتور باکتریوفاژی PL، یک ژن جهش یافته از رپرسور CI (۵۷CI)، برای کنترل فعالیت پروموتور، که محصول آن حساس به حرارت است و یک ترادف نشانه PelB به منظور هدایت پروتئین نوترکیب به فضای پریپلاسمی است. توانایی پلاسمیدهای ساخته شده با بیان hGM-CSF تحت القای حرارتی در اشریشیاکلی آزمایش شده است. نتایج: نتایج حاصل از آنالیز پروتئین های باکتری های نوترکیب (۱TG) حاوی هر یک از دو پلاسمید نوترکیب بعد از شوک حرارتی بر بیان و پردازش کامل GM-CSF انسانی نوترکیب در فضای پریپلاسمی کلون های به دست آمده دلالت دارد. با هدف افزایش کاربردی پلاسمید حاوی خاتمه دهنده رونویسی برای بیان دیگر پروتئین های نوترکیب تحت القای حرارتی، توالی کلون سازی چندگانه ای (MCS) شامل یازده جایگاه برشی منحصر به فرد به این پلاسمید افزوده شد. نتیجه گیری: پلاسمیدهای ساخته شده در این تحقیق ابزارهای مناسبی را برای انجام مطالعات مربوط به بیان پروتئین های نوترکی در اشریشیاکلی فراهم کرده اند.

---

هایپرگلیکوزیلاسیون فرایندی است که در آن با استفاده از روشهای مهندسی ژنتیک و جهش ­زایی هدفمند یک جایگاه جدید N-گلیکوزیلاسیون (موتیف Asn-Xxx-Ser/Thr) به درون توالی اسیدآمینه ­ای پروتئین نوترکیب وارد می­ شود. در صورت اتصال گلیکن جدید به آسپاراژین موجود در این موتیف، هایپرگلیکوزیلاسیون رخ می­ دهد. این فرایند بویژه در صنعت تولید پروتئین­های دارویی بسیار مورد توجه است. ویژگی­های فارماکوکینتیکی داروهای نوترکیب، ممکن است تحت تاثیر گلیکن اضافه شده قرار ­گرفته و نیمه عمر آنها افزایش یابد. در این تحقیق، بر اساس مطالعات بیوانفورماتیکی، در دامنه گلای فاکتور ۹ انسانی یک جایگاه جدید N-گلیکوزیلاسیون از طریق جهش­ زایی هدفمند مبتنی بر PCR و تبدیل کدون اسیدآمینه آرژینین شماره ۳۷ به آسپاراژین ایجاد شد. توالی رمز کنندۀ فرم جهش یافته فاکتور ۹  انسانی بطور موازی با توالی طبیعی (به عنوان کنترل)، در وکتور بیانی pCEP۴ مجهز به پروموتر ویروس سایتومگالو (CMV)، همسانه سازی شده و بیان آنها در سلول­های HEK۲۹۳ مورد بررسی قرار گرفت. به منظور بررسی رخداد هایپرگلیکوزیلاسیون در نوع جهش یافته، از روش گرادیان SDS-PAGE دارای شیب غلظت آکریل­آمید و به دنبال آن وسترن بلاتینگ استفاده شد که نشان دهنده سنگین­تر بودن محصول جهش یافته نسبت به فرم طبیعی بود. همچنین پس از هضم با استفاده از آنزیم PNGase هر دو محصول طبیعی و جهش یافته وزن مولکولی یکسانی کسب کردند. این نتایج نشان داد که افزایش وزن مولکولی پروتئین جهش یافته ناشی از اضافه شدن گلیکن جدید بوده و تایید کننده رخداد هایپرگلیکوزیلاسیون است.
 

---

هدف: به‏طور عمده پروتئین‏های یوکاریوتی دارای پپتید نشانه هستند که نه تنها نقش محوری در کارآیی ترشح دارند بلکه در بیان پروتئین نیز اهمیت دارند. فاکتور ۹ انعقادی، گلیکوپروتئینی است که نقش محوری در مسیر انعقاد خون ایفا می‏کند. نقص یا کاهش تولید فاکتور ۹ منجر به بیماری هموفیلی B می‌شود. در این پژوهش، با هدف افزایش و کارآیی ترشح پروتئین فاکتور ۹، عملکرد پپتید نشانه پروترومبین انسانی در سامانه بیانی هترولوگ بررسی شد. به این منظور، کارآیی ترشح پپتیدهای نشانه ابتدا با برنامه‌های رایانه‌ای SignalP و PrediSi و سپس به‏صورت عملی ارزیابی شد. مواد و روش‌ها: با استفاده از روش‌های مولکولی، تکثیر پپتید نشانه پروترومبین انسانی و الحاق آن به بخش بالغ cDNA فاکتور ۹ انسانی انجام شد. سپس قطعه کایمریک حاصل در مقایسه با فاکتور ۹ انسانی با پپتید نشانه بومی در رده سلولی HEK۲۹۳T تحت تنظیم پروموتر سیتومگالوویروس (CMV) در شرایط گذرا به‏طور عملی آزمایش شد. با استفاده از نرم‌افزارهای پیشگویی کننده مبتنی بر الگوریتم شبکه‌های عصبی، امتیازی برای جایگاه برش و کارآیی ترشح پپتید نشانه پروترومبین انسانی و بومی فاکتور ۹ ارزیابی شد. میزان فاکتور ۹ بیان شده در محیط کشت سلول‌های نوترکیب با RT-PCR و الایزا بررسی شد. نتایج: بررسی‌های رایانه‌ای پیشگویی نمود که پپتید نشانه پروترومبین انسانی در مقایسه با پپتید نشانه بومی فاکتور ۹ کارآمدتر است. این پیشگویی با استفاده از روش‌های RT-PCR و الایزا علیه RNA کایمری و نیز پروتئین نوترکیب FIX به‌ترتیب تأیید شد. نتیجه‌ گیری: تحقیق حاضر نشان داد که پپتید نشانه پروترومبین انسانی نسبت به پپتید نشانه بومی پروتئین فاکتور ۹از کارآیی بالا‌تری برخوردار است. این موضوع با پیش‌بینی‌های حاصل از برنامه‌های رایانه‌ای مطابقت دارد. نتیجه این جایگزینی می‌تواند در فاز بیان پایدار بررسی شود.