---

به‌کارگیری آنزیم‌ها‌‌ در حلال‌‌های آلی به لحاظ بیوتکنولوژی و صنعتی حایز اهمیت است. یکی از مشکلات موجود در استفاده از آنزیم‌‌ها در حلال‌‌های آلی، کاهش پایداری آنزیم‌‌ها است. جهت رفع این مشکل از روش‌‌های پایدارسازی پروتئین‌‌ها همچون استفاده از افزودنی‌ها‌‌ بهره گرفته می‌‌شود. در این تحقیق فعالیت و پایداری آنزیم تریپسین در درصدهای مختلف از حلال‌‌های آلی مورد بررسی قرار گرفت. سپس با استفاده از ساکارز پایداری آنزیم در حلال‌‌های آلی ارزیابی گردید. نتایج نشان داد که فعالیت تریپسین در غلظت‌‌های مختلف از حلال‌‌های آلی کاهش می‌‌یابد. میزان کاهش در مورد DMF کمتر از سایر حلال‌‌ها است. با بررسی پایداری آنزیم مشاهده شد که پایداری آنزیم در حلال‌‌های آلی کاهش می‌‌یابد. این کاهش با افزایش Log P حلال‌‌ها رابطه مستقیم دارد. پایداری آنزیم در حضور DMF در مقایسه با سایر حلال‌‌ها بیشتر بود. با افزودن ساکارز، تریپسین در مقابل حلال‌‌ها پایدار گردید که میزان پایدار شدن در حلال DMF بیشتر از حلال‌‌های دیگر بود. در آخر با توجه به نتایج، جهت به‌کارگیری تریپسین در حلال‌‌های آلی، مخلوط DMF و ساکارز پیشنهاد می‌‌شود.

---

آنزیم اندوگلوکاناز Cel۹A از باکتری آلیسیکلوباسیلوس اسیدوکالداریوس (AaCel۹A) یک آنزیم گرمادوست بوده و پیوندهای بتا ۱ به ۴ را در مولکول سلولز به طور اتفاقی هیدرولیز کرده و الیگوساکاریدهایی با سرهای احیا کننده تولید می‌کند. در این تحقیق ابتدا وکتور pDEST۱۷ حاوی ژن آنزیم AaCel۹A جهت بیان پروتئین نوترکیب به میزبان مناسب (اشریشیا کلی سویه BL۲۱) منتقل شده و بعد از بیان، با استفاده از ستون نیکل آگارز خالص گردید. سپس با توجه به تاثیر گذاری pH، دما و کلسیم بر روی فعالیت و پایداری آنزیم، با استفاده از این سه متغییر فعالیت آنزیم با استفاده از روش رویه پاسخ بهینه گردید. نتیجه الکتروفورز ژل SDS-PAGE نشان داد که آنزیم نوترکیب در حدود ۵۹ کیلو دالتون وزن مولکولی داشته و به خوبی بیان و خالص شده است. نتایج روش رویه پاسخ نشان داد که تاثیر pH بر روی فعالیت آنزیم بیشتر از دما، و دما بیشتر از کلسیم بوده و بهینه شرایط فعالیت آنزیم AaCel۹A در محیط با ۳۵/۶ pH، دمای°C۵/۶۴ و غلظت کلسیم برابر با ۹۲/۴ مولار است. در نهایت با توجه به همبستگی بالای نتایج آزمایشگاهی و نتایج پیش بینی شده می توان گفت مدل پیشنهادی در این تحقیق برای پیش بینی شرایط بهینه فعالیت آنزیم از صحت بالایی برخوردار است.

---

سلولاز آنزیمی پرکاربرد در صنایع مختلف می باشد. تثبیت سلولاز یکی از روش‌های پایدارسازی آن است که نه تنها امکان جداسازی آنزیم از واکنش، بلکه امکان استفاده مجدد از آن را فراهم می‌سازد و در نتیجه هزینه استفاده آنزیم در صنعت به طور قابل توجهی کاهش می‌یابد. استفاده از کیتوزان به عنوان بستر جهت تثبیت آنزیم و استفاده گسترده آن در فرآیند‌های صنعتی همواره مورد توجه بوده است. ویژگی‌های فوق العاده از جمله زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری و غیر سمی بودن آن، کیتوزان را بستری مناسب جهت فرآیند تثبیت معرفی می‌کند. در این مطالعه توالی ژنی کد کننده آنزیم اندوگلوکاناز AaCel۹A در وکتور بیانی pET۲۸a(+) همسانه سازی شد. نتایج حاصل از تعیین توالی مؤید قرارگیری صحیح قالب ژنی AaCel۹A در وکتور بود. سپس وکتور حاوی ژن به سلول های مستعد اشریشیا کلی سویه BL۲۱ منتقل شده و بیان پروتئین در آن ها القا شد. بیان آنزیم با استفاده از روش الکتروفورز SDS-PAGE و سنجش فعالیت آنزیم تایید و با ستون نیکل آگارز تخلیص بعمل آمد. ساخت ماکروبیدهای کیتوزان با روش ژله ای شدن صورت گرفت. مولکولهای آنزیم با استفاده از لینکرهای گلوتارآلدئیدی به صورت کووالان به بستر متصل و تایید تثبیت آنزیم توسط FTIR و نیز سنجش فعالیت آنزیمی از ماکروبیدهای حاوی آنزیم انجام پذیرفت. آنالیز نتایج نشان داد که بهترین شرایط برای تثبیت کوالان آنزیم بر روی بستر در غلظت گلوتارآلدئید ۷/۰% و بافر سدیم فسفات (۷ pH) می باشد. همچنین آنالیز برادفورد و سنجش فعالیت آنزیمی مؤید تثبیت ۸۵% از مولکول‌های آنزیم برروی بستر بود.

---

اوریکاز یا اورات اکسیداز آنزیمی است که باعث تبدیل اوریک اسید (کم محلول) به ۵- هیدروکسی ایزواورات و در نهایت آلانتوئین می شود. افزایش اوریک اسید در انسان باعث بیماری هایی همچون نقرس و سنگ های کلیوی می گردد. بنابراین اوریکاز می تواند به عنوان یک آنزیم دارویی جهت کاهش سطح اوریک اسید خون مورد استفاده قرار گیرد. یکی از مشکلات استفاده از پروتئین ها (همچون آنزیم-های دارویی)، پایداری کم آن ها است. روش های مختلفی از جمله استفاده از افزودنی ها، جهت پایدارسازی پروتئین ها استفاده می شود.در این تحقیق وکتور بیانی pET۲۸a (+) حاوی ژن اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس به اشریشیاکلی سویه BL۲۱ (DE۳) منتقل و سپس پروتئین نوترکیب بیان و با ستون کروماتوگرافی نیکل آگارز تخلیص شد. پس از تخلیص آنزیم ، پایداری حرارتی آنزیم خالص بررسی شده و آنزیم با افزودنی ها پایدار شد. نتایج نشان داد که آنزیم به خوبی تخلیص شده و فعال است. بررسی پایداری آنزیم نشان داد که اوریکاز تا دمای ۲۰ درجه سانتیگراد پایداری خود را حفظ کرده و بعد از آن پایداری خود را از دست می دهد بطوریکه نیمه عمر آن در ۴۰ درجه سانتیگراد ۳۰ دقیقه است. نتایج پایدارسازی آنزیم با استفاده از ۲۰% از گلوکز، سوربیتول و گلیسرول نشان داد که گلوکز بیشترین اثر پایدارکنندگی را بر روی اوریکاز داشته و تا بیش از دو برابر نیمه عمر آن را بالا برده است. در نهایت می توان نتیجه گرفت افزودنی هایی همچون گلوکز که باعث افزایش کشش سطحی می شوند، بیشترین اثر پایدارکنندگی را روی آنزیم اوریکاز دارند.