---

خلاصه آنزیم آدنوزین تری فسفات سولفوریلاز ( ATPS ) دربسیاری از انواع موجودات وجود دارد. نقش های فیزیولوژیکی مختلفی در موجودات مختلف به آنزیم ATPS نسبت داده شده که می‌توان به جذب و احیای سولفات و بازیابی پیروفسفات اشاره کرد. همچنین آنزیم دارای کاربردهای صنعتی و آزمایشگاهی متنوعی است. هدف این مطالعه کلون و بیان ژن تولید کننده پروتئین نوترکیب ATPS ازیک سوش ژئو باسیلوس ایرانی بود. بعد از جداسازی و تعیین سوش باکتری ژئوباسیلوس کواستافیلوس ، DNA ژنومی آن استخراج شد. با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن ATPS، ژن مورد نظر از رویDNA ژنومی تکثیر شد. نتیجه انجام PCR ژن ATPS به صورت یک باند ۱۱۸۸ جفت بازی بر روی ژل آگاروز مشاهده شد. سپس محصول PCR تخلیص و داخل وکتور کلونینگ کلون شد. باند مربوطه پس از کلونینگ توالی یابی شد و نتیجه بررسی همولوژی آن در بانک اطلاعاتی NCBI تایید کرد که قطعه کلون شده مربوط به ژن ATPSاست. ژن مورد نظر در پلاسمید بیانی pET ۲۸a ساب کلون شد. امکان بیان پروتئین نوترکیب ATPS در باکتری BL۲۱(DE۳)ازروی ORF کلون شده با استفاده از ژل SDS-PAGEبررسی شد. آنالیز پروتئین بیان شده بر روی ژل SDS-PAGE یک باند ۴۷,۵ کلیو دالتونی را نشان داد. سنجش فعالیت آنزیمی پروتئین مورد نظر به روش لومینسانس ATP نشان داد که پروتئین نوترکیب دارای فعالیت می‌باشد. این اولین مطالعه در رابطه با کلون، بیان و تعیین فعالیت آنزیمی ژن ATPS از باکتری ژئوباسیلوس کواستافیلوس می‌باشد.

---

تولید پروتئین های نوترکیب بطورمثال β-NGF با استفاده از میزبان های پروکاریوتی موضوع بسیاری ازمطالعات چنددهه اخیر می باشد. با وجود اینکه محیط های کشت باکتریایی نسبت به محیط کشتهای مخصوص سلول های یوکاریوتی ارزان تر و مقرون به صرفه تر می باشند اما وقتی همین محیط ها در مقیاس های صنعتی استفاده می شوند هزینه گزافی را به شرکت های زیست فناور تحمیل می نمایند. لذا یافتن محیط کشتی ارزان قیمت و دردسترس که باکتری های نوترکیب در آن قادر به رشد و تولید پروتئین های نوترکیب باشند از اهم بسیاری تحقیقات می باشد. درمطالعه حاضر برای اولین بار از مخلوط شیره خرما و عصاره مخمربه عنوان محیط کشتی ارزان قیمت استفاده شد. در بررسی RSM (response surface methodology) از غلظت های مختلف شیره خرما و عصاره مخمر به عنوان منابع کربن و نیتروژن مورد نیاز برای رشد باکتری ها استفاده شد و نشان داده شد که بالاترین میزان رشد در غلظت g/lit ۲۰ و ۵ کربن و نیتروژن می باشد. همچنین نشان داده شد که باکتری ها در این محیط علاوه بر رشد، قادر به تولید پروتئین نوترکیب (بطور مثال β-NGF) نیز می باشند.

---

---

---

 اکتیوین A یکی از اعضای خانواده‌ی فاکتور رشد تغییردهنده‌ی بتا (TGF-β) است که نقش مهمی در فرآیندهای فیزیولوژیکی متعدد همانند تمایز سلولی، ترمیم بافتی، رگ زایی، تمایز سلول های بنیادی، چسبندگی سلولی و آپوپتوز دارد. لذا با توجه به کاربردهای بالینی متعدد این پروتئین، تولید نوترکیب آن سودمند می‌باشد.از آنجاییکه اشرشیاکلی یکی از محبوب ترین میزبان ها برای تولید پروتئین‌های نوترکیب است، در این تحقیق از بیان سیتوپلاسمی در این سویه به منظور تولید مقادیر بالایی از اکتیوین A استفاده گردید. بدین منظورابتدا cDNA ناحیه‌ی بالغ ژن اکتیوین A  تکثیر و در وکتور (+)pET۲۸a کلون گردید. وکتور حاصل به سویه‎های (DE۳)BL۲۱،  plysS(DE۳)BL۲۱ و  Rosetta gami (DE۳)BL۲۱ انتقال داده شد. پس از القای پروموتر با استفاده از IPTG و بیان پروتئین، تولید  اکتیوین A  به وسیله‌ی روش های SDS-PAGE و وسترن بلات تایید شد. نتایج نشان داد که بیان اکتیوین A در سیتوپلاسم هر سه سویه یک رویکرد موثر برای دست‌یابی به میزان بالایی از پروتئین نوترکیب است اما در این بین، سویه (DE۳)BL۲۱ مقدار بیشتری پروتئین تولید کرده است. در مرحله ی بعد به منظور دست یابی به شکل محلول اکتیوین A از بیان همزمان چپرون‌های سیتوپلاسمی TF، GroEL/ES و DnaK/J  با وکتور (+)pET۲۸a که حامل اکتیوینA بود استفاده شد. نتایج SDS-PAGE و وسترن بلات نشان داد که بیان همزمان اکتیوین A با استفاده از پلاسمید چپرونی pGro۷ که دارای چپرون های GroEL و GroES می‌باشد، در سویه‌ی(DE۳)BL۲۱ یک رویکرد مؤثر برای تولید پروتئین اکتیوین A محلول است.

---

هدف: پروتئازها از مهم­ترین آنزیم­های صنعتی محسوب می­شوند. معمولاً برای تولید این آنزیم­ها از باکتری­های جنس باسیلوس استفاده می­شود. هدف از این پژوهش همسانه­سازی، تعیین توالی، بیان و بررسی بیوانفورماتیکی ژن سرین پروتئاز aprX استخراج شده از باکتری باسیلوس لیکنی­فورمیس بود.
مواد و روش­ها: پس از استخراج DNA باکتریایی، ژن سرین پروتئاز با نام aprX از باکتری Bacillus licheniformis جداسازی و در ناقل pTG۱۹-T  و سپس ناقل pET۲۸a(+) همسانه­سازی شد و ساختار مولکولی، ویژگی­های بیوشیمیایی و فیلوژنتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت و ساختار سه بعدی آنزیم همسانه­سازی شده پیش­بینی شد. جهت القای بیان ژن نوترکیب سرین پروتئاز از القاگر IPTG استفاده گردید و بیان پروتئین در غلظت­های مختلف IPTG، دماهای مختلف و زمان­های گوناگون مورد بررسی قرار گفت. تأیید بیان ژن aprX توسط آنالیز SDS-PAGE و دات بلاتینگ انجام شد. در ادامه نیز فعالیت آنزیم پروتئاز نوترکیب در دما و pH های گوناگون مورد سنجش قرار گفت.
یافته­ها: درستی همسانه­سازی به وسیله توالی­یابی تأیید شد. بر اساس نتایج حاصل از بررسی­های فیلوژنتیکی، توالی پروتئینی به دست آمده شباهت زیادی را با توالی­های سایر باسیلوس­ها نشان داد. پس از ارزیابی مدل­ها مشخص گردید که مدل­های ارائه شده توسط نرم­افزارهای RAPTORX و I-TASSER مدل­های مطلوبی برای پیش­بینی ساختار سه بعدی این پروتئاز هستند. تولید پروتئین نوترکیب با القاء IPTG به میزبان حاوی پلاسمید pET۲۸a-aprX با موفقیت انجام شد. بیشترین مقادیر بیان پروتئین نوترکیب در دمای ۲۵ درجه و طی زمان ۲۰ ساعت و با IPTG ۵/۰ میلی­مولار به‏دست آمد.

---

باکتری اشرشیاکلی یکی از مهمترین میزبان ­های مورد استفاده برای تولید پروتئین نوترکیب می ­باشد. به عنوان مثال، بیشتر پروتئین­ های دارویی که توسط سازمان غذا و داروی  آمریکا جهت مصرف مورد تایید قرار گرفته ­اند در اشرشیاکلی تولید شده اند. یکی از مزیت­ هایی که این موجود را به یک کارخانه مناسب جهت تولید پروتئین­های نوترکیب تبدیل کرده، شناخت کامل ماهیت زیستی آن می­ باشد. این امر سبب شده است که در سال­ های اخیر امکان ایجاد تغییرات جهت دار برای مبدل ساختن این کارخانه کوچک به سامانه­ ای هوشمند برای ساخت آسان­تر انواع پروتئین ­های نوترکیب با ویژگی­ های گوناگون فراهم شود. به طوری که هم اکنون سویه­ های مهندسی شده­ ی مختلف و بسیار پرکاربردی برای تولید مقدار بالا و پایدار پروتئین­ های مورد نظر از سویه­ های والد و وحشی به دست آمده است که در آزمایشگاه و صنعت قابل استفاده می­ باشد. در این مقاله مروری ما به معرفی تعدادی از این سویه­ ها که پرکاربردتر هستند می­ پردازیم.

---

هدف: BMP-۷ عامل رشد چند منظوره‏ای است که اغلب به دلیل خواص استخوان‏زایی خود شناخته شده است. به دلیل قیمت بالا، دسترسی به این پروتئین برای مصارف درمانی محدود است. تاکنون تولید هترولوگ پروتئین نوترکیب BMP-۷ در تعدادی از سیستم‏های بیانی انجام یافته است. در مطالعه حاضر شکل جدیدی از پروتئین در میزبان‏های پروکاریوتی و یوکاریوتی بیان شده است. مواد و روش‏ها: برای بیان در سیستم بیانی پروکاریوتی، پروتئین جدید به فضای پری‏پلاسمی باکتری اشریشیا کلی ترشح شد و تخلیص توسط ستون تمایلی انجام گرفت. برای بیان در سیستم بیانی یوکاریوتی، قطعه cDNA با طول کامل به سلول یوکاریوتی CHO منتقل شد و کلون‏های پایدار انتخاب شد. بیان پروتئین نوترکیب در هر دو سیستم بیانی توسط آزمون وسترن بلات تأیید شد. نتایج: پروتئین نوترکیب جدید به صورت دایمر با وزن مولکولی ۳۶-۳۸ کیلودالتون در سلول یوکاریوتی و به صورت مونومر با وزن مولکولی ۱۶ کیلودالتون در سیستم بیانی اشریشیا کلی تولید شد. تجزیه و تحلیل کمّی با استفاده از الایزا نشان داد که سطح بیان جهش یافته در سیستم بیانی یوکاریوتی و پروکاریوتی به ترتیب ۴۰ و ۱۳۵ نانوگرم در هر میلی‏لیتر از محیط کشت است. نتیجه‏گیری: در این مطالعه سطح بیان پروتئین در اشریشیا کلی حداقل ۳ برابر میزان بیان در سلول یوکاریوتی بود. با این وجود بهینه‏سازی‏های بیشتر برای به‏دست آوردن مولکول دایمر در اشریشیا کلی مورد نیاز است. نتایج مطالعه مذکور نشان داد که بیان پری‏پلاسمی ممکن است برای تولید پروتئین‏های پیچیده مانند BMPs مناسب باشد.

---

هدف: سرطان سینه از علل عمده مرگ و میر زنان در سراسر جهان است. درمان‏های دارویی متعارف با استفاده از داروهای سیتوتوکسیک دارای سطح بالایی از عوارض جانبی برای بیمار است. امروزه محققین به دنبال درمان جایگزین با آثار جانبی کم و حداکثر بهره‏وری هستند. oipA یکی از مهم‏ترین پروتئین‏های غشای خارجی هلیکوباکتر پیلوری است. هدف این مطالعه بررسی اثر توکسیسیتی پروتئین نوترکیب غشای خارجی التهاب ی(oipA) هلیکوباکتر پیلوری بر رده سلولی سرطانی سینه در شرایط آزمایشگاهی است. مواد و روش‏ها: بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب OipA با استفاده از ستون نیکل انجام شد. از واکنش آنتی‏بادی پلی‏کلونال ضد پیکره هلیکوباکتر پیلوری با باندهای پروتئینی برای اثبات حضور پروتئین استفاده شد. سلول‏های سرطانی سینه ۴T۱ با غلظت‏های مختلف پروتئین تیمار شد. میزان بقای سلولی با آزمون MTT سنجیده شد. نتایج: واکاوی SDS-PAGE بیان پروتئین را تأیید کرد. اندازه پروتئین بیان شده ۳۴۰۰۰ دالتون بود. نتایج آزمون MTT در زمان ۲۴ ساعت نشان داد که پروتئین OipA در غلظت ۲۵۰ میکروگرم/ میلی‏لیتر روی سلول‏های سرطانی سینه ۴T۱ دارای اثر سیتوتوکسیک است. نتیجه‏گیری: در این مطالعه اثر توکسیک پروتئین OipA مشاهده شد. OipA به‏طور مستقیم بر سلول‏های سرطانی سینه اثر توکسیک دارد. این پروتئین ممکن است به‏عنوان یک ابزار جدید برای راه‏کار‏های درمانی در آینده برای درمان سرطان مطرح باشد.

---

هدف به‏دست آوردن آنتی‏بادی اختصاصی با ایمن‏سازی توسط پروتئین نوترکیب و خالص‏سازی به کمک پپتید مصنوعی به‏عنوان روشی جدید (مدل PrIPeP). مواد و روش‌ها: آنتی‏ژن پروتئینی با همسانه‏سازی ژن کامل SRY روی ناقل pET۲۸a و بیان پروتئین نوترکیب آن در سویه Bl۲۱ باکتری اشریشیا کلی تولید شد. پپتیدی اختصاصی از این پروتئین نیز طراحی و پس از سنتز برای ساخت ستون خالص‏سازی استفاده شد. پروتئین نوترکیب در ادجوانت فروند به‏صورت امولسیون در آمد و طبق جدول زمانی استاندارد برای ایمن‏سازی در خرگوش به‏کار رفت. به‏عنوان شاهد، پپتید سنتز شده به پروتئین حامل KLH کونژوگه و مانند پروتئین نوترکیب برای ایمن‏سازی استفاده شد. برای بررسی نتایج، ابتدا درستی ایمن‏سازی به‏وسیله روش الایزا بررسی شد. سپس آنتی‏سرم حاصل از تزریق پروتئین نوترکیب (Pro-antisera) با استفاده از ستون خالص‏سازی شامل پپتید کونژوگه به سفارز خالص‏سازی شد (مدل PrIPeP). آنتی‏سرم حاصل از تزریق پپتید کونژوگه به KLH (Pep-antisera) نیز با همین ستون خالص‏سازی شد. در نهایت، اختصاصیت و حساسیت آنتی‏بادی‏های خالص شده نسبت به پروتئین نوترکیب SRY و همچنین چند شاهد منفی (پروتئین نوترکیب HSFY، RBMY و RPS۴Y) با استفاده از روش لکه‏گذاری وسترن بررسی شد. نتایج: تیتراسیون با روش الایزا نشان داد که ایمن‏سازی برای هر ۲ نوع آنتی‏ژن به‏خوبی و به‏طور اختصاصی انجام شد. همچنین تجزیه و تحلیل آنتی‏بادی‏های خالص کلاس IgG با روش لکه‏گذاری وسترن نشان داد که اختصاصیت و حساسیت آنتی‏بادی در هر دو گروه مناسب است. نتیجه‌گیری: نتایج بررسی حاضر نشان داد که با استفاده از مدل PrIPeP می‏توان از یک سو به آنتی‏بادی‏های اختصاصی دست یافت که علیه ساختار طبیعی پروتئین تولید شده‏اند و از سوی دیگر از چالش‏های کونژوگاسیون پپتید به پروتئین حامل اجتناب کرد.