جستجو در مقالات منتشر شده
۲ نتیجه برای زنجیره سبک
فیروز ابراهیمی، علیرضا فراست، سید جعفر موسوی، سامان حسینخانی، عباس حاجی زاده، شهرام نظریان،
دوره ۳، شماره ۲ - ( ۹-۱۳۹۱ )
چکیده
نوروتوکسین‌های بوتولینوم، سمی ترین ترکیبات بیولوژیک شناخته شده‌اند که باعث ایجاد فلج عضلانی میشوند. خاصیت آنزیمی این توکسین‌ها، مهار آزادسازی میانجی عصبی استیل کولین را باعث میشود. مطالعه حاضر با هدف تولید نوترکیب بخش کاتالیتیک (زنجیره سبک) سم بوتولینوم تیپ A با درصد خلوص بالا، به‌منظور ارزیابی فعالیت آنزیمی انجام‌شد. توالی ژن زنجیره کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ A از پایگاه ژنی NCBI گرفته‌شد. پس از بهینه‌سازی کدون ترجیحی ژن مورد نظر برای E.coli، توالی نهایی ژن به‌منظور سنتز در وکتور بیانی pET۲۸a(+) سفارش داده شد. پس از انتقال وکتور بیانی نوترکیب دارای ژن مذکور به میزبان E.coli BL۲۱-DE۳ ، فرایند بیان در شرایط استاندارد انجام شد. در ادامه تولید پروتئین مورد نظر به شکل محلول با بهینه سازی کشت میزبان و بیان پروتئین صورت پذیرفت. پروتئین بیانی به وسیله ستون Ni-NTA تخلیصو با آنتی بادی اختصاصی مورد تأیید قرار گرفت. در این تحقیق بالاترین میزان بیان به شکل محلول، در شرایط غلظت ۵/۰ میلی مولار IPTG، با جذب نوری ۵/۰ و زمان القای ۱۸ ساعت در دمای ۱۸ درجه سانتی گراد به‌دست آمد. آزمایش‌های وسترن بلات و الایزا، وجود پروتئین هدف را تأیید‌کردند.براساس نتایج، زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ A به شکل محلول تولید شد. فرایند تخلیص نیز با رزین تمایلی با کیفیت عالی انجام شد به طوری‌که پروتئین مورد نظر با درصد خلوص ۹۸ به‌دست آمد.
دوره ۲۱، شماره ۲ - ( ۴-۱۳۹۷ )
چکیده
اهداف: نوروتوکسین‌های بوتولینوم، از قوی‌ترین سم‌های شناخته‌شده هستند که با مهار آزادسازی میانجی عصبی استیل‌کولین، موجب ایجاد فلج شل عضلانی میشود. طراحی مهارکننده‌ها هنوز به‌عنوان یک راهبرد اصلی برای مهار درون‌سلولی مسمومیت‌های ناشی از سموم مذکور به‌شمار می‌آید. برای بررسی پتانسیل عملکرد مهارکننده‌های طراحی‌شده، به سم خالص یا ناحیه کاتالیتیک آن نیاز است. هدف مطالعه حاضر، بررسی بیان و تخلیص ناحیه کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E BoNT/E)) نوترکیب از یک ژن صناعی بود.
مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربی حاضر، توالی زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E از بانک ژن به‌دست آمد و بهینه‌سازی کدونی براساس E. coli BL۲۱ انجام شد. سایر بررسی‌های بیوانفورماتیک لازم برای بیان بهتر ژن صورت گرفت. توالی ژن برای سنتز و همانندسازی در وکتور pET۲۸a(+) سفارش داده شد. وکتور نوترکیب داخل باکتری E. coli BL۲۱ انتقال و بیان پروتئین با ایزوپروپیل‌تیو-بتا-دی‌گالاکتوزیداز (IPTG) القا شد. برای بیان محلول، در شرایط بیانی تغییر صورت گرفت. سپس به‌وسیله کروماتوگرافی تمایلی و فیلتر آمیکون پروتئین خالص‌سازی شد. برای بررسی بیان و خالص‌سازی پروتئین SDS-PAGE و برای تایید پروتئین بیان‌شده تکنیک وسترن‌بلات به‌کار رفت.
یافته‌ها: شاخص سازگاری کدون ژن به ۰/۸۵ افزایش یافت. ساختار سوم پیش‌بینی‌شده کیفیت مناسب را نشان داد. ساختار mRNA نشان داد، ساختار پیش‌بینی‌شده پایدار بود. بیان محلول پروتئین در شرایط °C۱۸ به‌مدت ۱۸ساعت با القای IPTG، یک‌میلی‌مولار به‌دست آمد. تولید پروتیئن و با خلوص بالای ۹۰% تایید شد.
نتیجه‌گیری: بهینه‌سازی شرایط بیان پروتئین زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ E موجب تولید محلول آن در محیط کشت توسط میزبان E. coli BL۲۱ میشود.
