---

لنتی ویروسها از جمله موثرترین ویروسهای نوترکیب برای انتقال ژن به سلولها و بافتهای پستانداران بشمار میرود. در این مطالعه، عملکرد لنتی ویروسهای انسانی را در انتقال ژن خارجی به سلولهای طیور بررسی کردیم. سه ناقل لنتی ویروسی بنامهای ناقل انتقال (ناقل ترانسفر حامل ژن گزارشگر GFP)، ناقل بسته بندی و ناقل غشائی را همزمان به سلولهای مولد ویروس (رده HEK-۲۹۳T) منتقل کردیم. سوپرناتان سلولهای ترانسفکت شده را پس از ۲۴ و ۴۸ ساعت جمع آوری نموده از فیلتر گذراندیم. سپس آن را به ستونهای پروتئینی Amicon حاوی فیلتر ۱۰۰ کیلو دالتونی منتقل کرده و بخش اعظم سوپرناتان را با استفاده از سانتریفوژ از نمونه ها جدا کردیم. بدین ترتیب استوکی در حجم ۵۰۰ µl از سوپرناتان غلیظ شده و مملو از ویریونها را بدست آوردیم. برای ترانسدوکشن سلولهای کبدی جوجه رده LMH رقتهای مختلفی از این استوک ویروسی تغلیظ شده را به محیط کشت این سلولهای در حال رشد اضافه کردیم. ۴۸ ساعت بعد آلودگی سلولی و بیان ترانسژنهای گزارشگر را مشاهده کردیم که میزان بیان آنها ۹۶ ساعت پس از آلودگی به ۱۰۰% افزایش یافت. نتایج مزبور نشان میدهد که سلولهای با منشاء جوجه را نیز میتوان بوسیله لنتی ویروسهای با منشاء انسانی آلوده ساخت. همچنین با توجه به نیاز به تیتر بالای ویروس برای انتقال موفقیت آمیز ژنها، روش فیلتراسیون تیتر بالایی از ویروس را تولید میکند و از نظر کارایی قابل مقایسه با روشهای سنتی از جمله روش اولتراساتریفوژ بوده و از نظر هزینه، حجم کار و زمانبری بر آنها ارجحیت دارد.

---

لنتی ویروسها از جمله موثرترین ویروسهای نوترکیب برای انتقال ژن به سلولها و بافتهای پستانداران بشمار میرود. این مطالعه شامل دو بخش اساسی است: (۱) بررسی کارائی ستونهای پروتئینی در تولید لنتی ویروسهای نوترکیب با تیتر بالا و (۲) بکارگیری این ستونها درتولید لنتی ویروسهای نوترکیب حامل ژن فاکتورنوروتروفیک GDNF. در بخش اول مطالعه با استفاده از دو ناقل انتقال (حامل GFP یا Jred) تولید لنتی ویروس نوترکیب کردیم. با انتقال سوپرناتان سلولهای ترانسفکت شده به ستونهای پروتئینی Amicon و سانتریفوژ ستونها بیش از ۹۹% سوپرناتان را جدا کردیم تا استوکی در حجم ۵۰۰ μl از سوپرناتان غلیظ شده و مملو از ویریونها بدست آید. با افزودن رقتهای مختلف این استوک ویروسی به سلولهای هدف، ترانسدوکشن سلولی با موفقیت انجام شد بطوریکه ترانسژنهای گزارشگر در ۱۰۰% سلولها مشاهده شد. متقابلا تست بخش رقیق سوپرناتان منجر به هیچگونه بیان ژن که نشانگر فعالیت ویروسی باشد نگردید. تولید تیتر بالای ویروسی با روش فیلتراسیون مزبور برای انتقال موفقیت آمیز ژنها اهمیت دارد و از نظر هزینه، حجم کار و زمانبری بر آنها ارجحیت دارد. در بخش دوم این مطالعه، توالی مربوط به فاکتور مهم GDNF را به سازه لنتی ویروسی پیوند زده و به همان روش بالا ویروسهای تیتر بالا تولید کردیم. با انتقال این ویروسها به آستروسیتهای انسانی توانستیم افزایش بیان ژن GDNF را در سطح mRNA بمیزان ۳ برابر بدست آوریم. این نتایج نشان دادکه لنتی ویروسهای حامل GDNF را میتوان با روش جاری در تیتر بالا تولید کرده و برای مطالعات تمایزی و حفاظت نورونی مورد استفاده قرار داد.

---

هدف: میکروRNA ها، RNA های غیر کد کننده‏ای است که به‏عنوان تنظیم کننده چندین فعالیت زیستی مثل متابولیسم، تکثیر و تنظیم سلولی عمل می‏کند. مطالعات اخیر نشان دهنده پتانسیل بالای این مولکول‏های کوچک در تمایز سلول‏های بنیادی به سلول‏های مشخص است. هدف از مطالعه حاضر ارزیابی اثر let-۷f بر بیان ژن عامل هسته‏ای کبد (HNF۴a) و عوامل خاص کبدی از جمله آلبومین، آلفا فیتوپروتئین، سیتوکراتین ۱۸ و سیتوکراتین ۱۹ در سلول‏های بنیادی جدا شده از بافت چربی انسانی است. مواد و روش‏ها: سلول‏های بنیادی جدا شده از بافت چربی تحت تأثیر آنزیم کلاژناز نوع I از بافت چربی انسانی استخراج شده و سپس با استفاده از لنتی‏ویروس‏های حاوی مهار کننده let-۷f و Scramble (کنترل منفی) ترانسداکت شدند. سپس تغییر در سطح بیان ژن‏های HNF۴a، آلبومین، آلفا فیتوپروتئین، سیتوکراتین ۱۸ و سیتوکراتین ۱۹ در زمان‏های متفاوت با استفاده از روش Real-time PCR بررسی شد. نتایج: کارآیی ترانسداکشن ناقل‏های لنتی ویروسی در سلول‏های بنیادی جدا شده از بافت چربی انسانی بیش از ۸۰ درصد بود که با بررسی بیان پروتئین فلورسانت سبز ارزیابی شد. نتایج Real-time PCR نشان داد که مهار let-۷f در سلول‏های بنیادی جدا شده از بافت چربی انسانی منجر به افزایش معنی‏دار در بیان ژن‏های خاص کبدی در مقایسه با کنترل منفی می‏شود. همچنین بیان ژن HNF۴a روز چهاردهم بعد از ترانسداکشن افزایش داشت که تأیید کننده سرکوب ژن HNF۴a توسط let-۷f است. نتیجه‏گیری: نتایج این تحقیق نشان داد که let-۷f به‏عنوان یک تنظیم کننده منفی در بیان ژن HNF۴a عمل می‏کند و مهار let-۷f منجر به افزایش بیان نشانگرهای ویژه کبدی می‏شود. بنابراین مهار let-۷f می‏تواند ابزار مؤثری در به راه‏اندازی تمایز سلول‏های بنیادی جدا شده از بافت چربی انسانی به سمت رده هپاتوسیتی باشد.

---

هدف: RNA مداخله‌گر یک مکانیسم کارآمد در کاهش بیان ژن‌ها و تعیین عملکرد ژن‌ها است. وکتورهای لنتی ویروسی ابزارهای مناسبی برای انتقال ژن‌های خارجی به طیف گسترده‌ای از سلول‌های پستانداران هستند. پروتئین Fndc۵ یک پروتئین گلیکوزیله غشایی است که بیان آن طی روند تمایز قلبی و عصبی سلول‌های بنیادی جنینی موشی (mESCs) افزایش می‌یابد. در این مطالعه به بررسی قابلیت کاهش بیان ژن Fndc۵ در mESCs با استفاده از وکتورهای لنتی ویروسی بیان کننده shRNA می‌پردازیم. روش‌ها: به این منظور دو توالی مشخص shRNA علیه ناحیه کد کننده رونوشت Fndc۵ و یک توالی shRNA کنترل به عنوان کنترل منفی طراحی و سنتز شد. قطعات shRNA سنتزی پس از هیبرید شدن درون وکتور لنتی ویروسی در پایین دست پروموتر H۱ القا شونده توسط تتراسایکلین کلون شدند. وکتور لنتی ویروس‌ نوترکیب درون سلول‌های HEK۲۹۳T بسته بندی شد و mESCs توسط ذرات ویروسی ترانسداکت شدند. بیان shRNA در سلول‌های ترانسداکت شده توسط ۴۸ ساعت تیمار با داکسی سایکلین القا گردید.
نتایج: سنجش میزان بیان رونوشت Fndc۵ توسط Real-time PCR در سلول‌های ترانسداکت شده با ویروس‌های نوترکیب حامل هر دو shRNA، کاهش بیان معنادار نسبت به گروه کنترل نشان داد.
نتیجه‌گیری: در مجموع هدف قرار دادن ژن‌ Fndc۵ از طریق مکانیسم RNA مداخله گر می‌تواند به عنوان یک ابزار کارآمد در کاهش بیان این ژن در لاین سلولی ترانسداکت شده به منظور بررسی عملکرد Fndc۵ مورد توجه قرار بگیرد.