---

همزمان با توسعه داروهای پروتئینی نوترکیب، توجه به مسئله پایداری پروتئین های نوترکیب با مصرف دارویینیز از اهمیت بسزایی برخوردار است. در این تحقیق، پایداری اینترفرون گامای نوترکیب انسانی در بازه زمانی ۰-۹ ماه پس از تولید و در شرایط نگهداری دمایی متفاوت۴ و۲۵ بررسی شد. فعالیت بیولوژیک پروتئین و دایمرشدن کووالان، دآمیداسیون و اکسیداسیونپروتئین از طریق روش های کشت سلولمبتنی بر سنجش اثر فعالیت ضد ویروسی پروتئین، آنالیز کروماتوگرافی مایع فشار بالا و الکتروفورزSDS-PAGEارزیابی شد. نتایج بیانگر این است که فعالیت ضد ویروسی پروتئین در دمای ۴ تقریبا ثابت می ماند، اما روند کاهش فعالیت بیولوژیکبا افزایش دما در۲۵ ادامه می یابد. روند تشکیل فرم هایدآمیده-اکسیده و دایمر کووالان در دمای ۲۵ نسبت به ۴ طی زمان مذکور، سریع تر است.لذا نتایج نشان می دهد که اینترفرون گامای نوترکیب تولیدی در دمای ۴ نسبت به ۲۵ از پایداری بیشتری برخوردار است.

---

نوروتوکسین‌های بوتولینوم، سمی ترین ترکیبات بیولوژیک شناخته­­ شده‌اند که باعث ایجاد فلج عضلانی می­شوند. خاصیت آنزیمی این توکسین‌ها، مهار آزاد­سازی میانجی عصبی استیل کولین را باعث می­شود. مطالعه حاضر با هدف تولید نوترکیب بخش کاتالیتیک (زنجیره سبک) سم بوتولینوم تیپ A با درصد خلوص بالا، به‌منظور ارزیابی فعالیت آنزیمی انجام‌شد.  توالی ژن زنجیره کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ A از پایگاه ژنی NCBI گرفته‌شد. پس از بهینه‌سازی کدون ترجیحی ژن مورد‌ نظر برای E.­coli، توالی نهایی ژن به‌منظور سنتز در وکتور بیانی pET۲۸a(+) سفارش داده شد. پس از انتقال وکتور بیانی نوترکیب دارای ژن مذکور به میزبان E.­coli BL۲۱-DE۳ ، فرایند بیان در شرایط استاندارد انجام شد. در ادامه تولید پروتئین مورد نظر به شکل محلول با بهینه سازی کشت میزبان و بیان پروتئین صورت پذیرفت. پروتئین بیانی به وسیله ستون Ni-NTA تخلیصو با آنتی بادی اختصاصی مورد تأیید قرار گرفت. در این تحقیق بالاترین میزان بیان به شکل محلول، در شرایط غلظت ۵/۰ میلی مولار IPTG، با جذب نوری ۵/۰ و زمان القای ۱۸ ساعت در دمای ۱۸ درجه سانتی گراد به‌دست آمد. آزمایش‌های وسترن بلات و الایزا، وجود پروتئین هدف را تأیید‌کردند.براساس نتایج، زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ A به شکل محلول تولید شد. فرایند تخلیص نیز با رزین تمایلی با کیفیت عالی انجام شد به طوری‌که پروتئین مورد نظر با درصد خلوص ۹۸ به‌دست آمد.

---

خلاصه آنزیم آدنوزین تری فسفات سولفوریلاز ( ATPS ) دربسیاری از انواع موجودات وجود دارد. نقش های فیزیولوژیکی مختلفی در موجودات مختلف به آنزیم ATPS نسبت داده شده که می‌توان به جذب و احیای سولفات و بازیابی پیروفسفات اشاره کرد. همچنین آنزیم دارای کاربردهای صنعتی و آزمایشگاهی متنوعی است. هدف این مطالعه کلون و بیان ژن تولید کننده پروتئین نوترکیب ATPS ازیک سوش ژئو باسیلوس ایرانی بود. بعد از جداسازی و تعیین سوش باکتری ژئوباسیلوس کواستافیلوس ، DNA ژنومی آن استخراج شد. با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن ATPS، ژن مورد نظر از رویDNA ژنومی تکثیر شد. نتیجه انجام PCR ژن ATPS به صورت یک باند ۱۱۸۸ جفت بازی بر روی ژل آگاروز مشاهده شد. سپس محصول PCR تخلیص و داخل وکتور کلونینگ کلون شد. باند مربوطه پس از کلونینگ توالی یابی شد و نتیجه بررسی همولوژی آن در بانک اطلاعاتی NCBI تایید کرد که قطعه کلون شده مربوط به ژن ATPSاست. ژن مورد نظر در پلاسمید بیانی pET ۲۸a ساب کلون شد. امکان بیان پروتئین نوترکیب ATPS در باکتری BL۲۱(DE۳)ازروی ORF کلون شده با استفاده از ژل SDS-PAGEبررسی شد. آنالیز پروتئین بیان شده بر روی ژل SDS-PAGE یک باند ۴۷,۵ کلیو دالتونی را نشان داد. سنجش فعالیت آنزیمی پروتئین مورد نظر به روش لومینسانس ATP نشان داد که پروتئین نوترکیب دارای فعالیت می‌باشد. این اولین مطالعه در رابطه با کلون، بیان و تعیین فعالیت آنزیمی ژن ATPS از باکتری ژئوباسیلوس کواستافیلوس می‌باشد.

---

تولید پروتئین های نوترکیب بطورمثال β-NGF با استفاده از میزبان های پروکاریوتی موضوع بسیاری ازمطالعات چنددهه اخیر می باشد. با وجود اینکه محیط های کشت باکتریایی نسبت به محیط کشتهای مخصوص سلول های یوکاریوتی ارزان تر و مقرون به صرفه تر می باشند اما وقتی همین محیط ها در مقیاس های صنعتی استفاده می شوند هزینه گزافی را به شرکت های زیست فناور تحمیل می نمایند. لذا یافتن محیط کشتی ارزان قیمت و دردسترس که باکتری های نوترکیب در آن قادر به رشد و تولید پروتئین های نوترکیب باشند از اهم بسیاری تحقیقات می باشد. درمطالعه حاضر برای اولین بار از مخلوط شیره خرما و عصاره مخمربه عنوان محیط کشتی ارزان قیمت استفاده شد. در بررسی RSM (response surface methodology) از غلظت های مختلف شیره خرما و عصاره مخمر به عنوان منابع کربن و نیتروژن مورد نیاز برای رشد باکتری ها استفاده شد و نشان داده شد که بالاترین میزان رشد در غلظت g/lit ۲۰ و ۵ کربن و نیتروژن می باشد. همچنین نشان داده شد که باکتری ها در این محیط علاوه بر رشد، قادر به تولید پروتئین نوترکیب (بطور مثال β-NGF) نیز می باشند.

---

  چکیده در این تحقیق رنتهای نوترکیب، میکروبی و حیوانی، در تولید پنیر سفید ایرانی استفاده گردیده و پنیرهای تولیدی از نظر ویژگیهای شیمیایی، شاخص نرخ پروتئولیز، خصوصیات بافتی و برخی ویژگیهای حسی در طول دوره رسیدن مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفتند. نتایج بدست آمده نشان داد که درصد ماده خشک، نمک و  pH هر سه نوع پنیر با یکدیگر اختلاف معنی دار داشتند ( ۰۵/۰P<). پنیرهای تولید شده با رنت حیوانی و میکروبی به ترتیب دارای بیشترین و کمترین راندمان بودند. نتایج ارزیابی نرخ پروتئولیز حاکی از آن بود که هرسه تیمار از نظر شاخص مزبور با یکدیگر اختلاف معنی دار داشته (۰۵/۰P<) و این میزان در پنیر تولید شده با رنت میکروبی به طور معنی داری بیشتر از دو نوع دیگر بود. بیشترین و کمترین سفتی در پایان دوره رسیدن به ترتیب متعلق به پنیرهای تولید شده با رنت حیوانی و میکروبی بود. نتایج بررسی آرایش شبکه پروتئینی پنیر نیز نشان داد که با افزایش دوره رسیدن، ماتریکس پروتئینی کاهش یافته و بیشترین و کمترین کاهش به ترتیب مربوط به پنیرهای تولید شده با رنت میکروبی و حیوانی بود. از نظر ارزیابی حسی، بیشترین امتیاز مربوط به نمونه شاهد و کمترین مربوط به پنیر تهیه شده با رنت میکروبی بود. با توجه به یافته های این بررسی، پنیر تولید شده با رنت میکروبی نسبت به رنت حیوانی و نوترکیب از کیفیت پایین تری برخوردار بود و به دلیل کمبود رنت حیوانی، نحوه عمل رنت میکروبی و کیفیت پنیر حاصل از آن، به نظر می رسد که رنت نوترکیب بتواند به عنوان جایگزین مناسب در تولید پنیر مورد استفاده قرار گیرد.

---

مقدمه: هورمون رشد، یک رشته پلی‌پپتید غیرگلیکوزیله ترشحی از سلول‌های غدد هیپوفیز همه مهره‌داران است که تنوع وسیعی از فعالیت‌های زیستی را دارا بوده و با توجه به اهمیت این هورمون و کاربردهای درمانی مهم و متنوع آن در پزشکی، تولید نوترکیب آن می‌تواند از درجه اهمیت بالایی برخوردار باشد. در دهه‌های اخیر، مهندسی پروتئین و مهندسی ژنتیک سبب شده است که میزان بالایی از سطح بیان و تولید این پروتئین در میزبان‌های مختلفی از جمله باکتری اشریشیاکلی حاصل شود و با تکنیک‌های جدید، خالص‌سازی و سنجش هورمون تولیدی به‌آسانی انجام گیرد. بنابراین هدف پژوهش مروری حاضر، بررسی تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب (rhGH) و چالش‌های پیش رو انجام گرفت.
نتیجه‌گیری: از جمله مشکلاتی که در مسیر بیان و تخلیص هورمون رشد انسانی می‌توان به تولید اجسام توده‌ای در بیان پروتئین‌های نوترکیب در سیتوپلاسم سلول‌ها، آلودگی‌های ناشی از پروتئین‌های میزبان، ریکاوری پایین پروتئین از این توده‌ها، ترشح کم پروتئین‌ها به فضای پری‌پلاسمی، هزینه بالای تولید مخصوصاً در مرحله تخلیص و غیره اشاره کرد. به‌علت عدم نیاز به گلیکوزیله‌شدن این هورمون و نیز راندمان بالا و سادگی کار، سیستم‌های باکتریایی مخصوصاً اشریشیاکلی اقتصادی‌ترین و موثرترین سیستم‌ها در بیان پروتیئن‌های هترولوگ هستند و می‌توان عنوان کرد که باکتری اشریشیاکلی کارآمدترین میزبان برای تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب است. مرحله خالص‌سازی هورمون معمولاً پرهزینه‌ترین مراحل تولید محسوب می‌شود. از این رو یک طراحی مطلوب به‌منظور داشتن بالاترین میزان ریکاوری پروتئین هدف همراه با حذف همه آلودگی‌ها از محصول نهایی و کاهش مراحل تخلیص مورد نیاز است.

---

هدف: امروزه نشانگرهای DNA یکی از مهمترین شاخص‌ها در زمینه تخمین اندازه مولکولی نمونه‌های DNA هستند که در تمام آزمایشگاه‌های پزشکی و تحقیقاتی از آن استفاده می‌شود. اما متأسفانه در کشور ما، تاکنون این ماده ساخته نشده است و تمام نمونه‌های نشانگر استفاده شده در کشور، از شرکت های خارجی تهیه می‌گردد. هدف از انجام این تحقیق، ایجاد فناوری مناسب برای ساخت این ماده ارزشمند در سطح آزمایشگاه بود. مواد و روش‌ها: در این راستا، برای تهیه نشانگرهای DNA لامبدا از دو گونه مختلف لامبدا به نام‌های EMBL۳A و CI۸۵۷sam۷ که هر دو جز فاژهای لیتیک بودند و از پلاسمیدهای pBR۳۳۲ و pUC۱۸ و پلاسمیدهای نوترکیبVZV، به‌عنوان منبع DNA استفاده گردید. نتایج: در نهایت هفت نشانگر DNA ساخته شد که چهار عدد از آنها (Sam۱، Sam۲، /HindIII/BamH۱، /HindIII/EcoR۱) در نوع خود تازه بودند و به عنوان الگوهای جدید معرفی می‌شوند، ولی سه تای دیگر (/Hind III، /Pst I، pBR۳۳۲/MspI) مشابه خارجی هم دارند، و تولید آنها برای اولین بار است که در ایران انجام می‌شود. نتیجه‌گیری: بعد از طراحی و ساخت این نشانگرها، تلاش برای یافتن بهترین شرایط نگهداری و پایدارسازی نشانگرها به صورت موفقیت‌آمیزی انجام گرفت.

---

---

---

---

---

هایپرگلیکوزیلاسیون فرایندی است که در آن با استفاده از روشهای مهندسی ژنتیک و جهش ­زایی هدفمند یک جایگاه جدید N-گلیکوزیلاسیون (موتیف Asn-Xxx-Ser/Thr) به درون توالی اسیدآمینه ­ای پروتئین نوترکیب وارد می­ شود. در صورت اتصال گلیکن جدید به آسپاراژین موجود در این موتیف، هایپرگلیکوزیلاسیون رخ می­ دهد. این فرایند بویژه در صنعت تولید پروتئین­های دارویی بسیار مورد توجه است. ویژگی­های فارماکوکینتیکی داروهای نوترکیب، ممکن است تحت تاثیر گلیکن اضافه شده قرار ­گرفته و نیمه عمر آنها افزایش یابد. در این تحقیق، بر اساس مطالعات بیوانفورماتیکی، در دامنه گلای فاکتور ۹ انسانی یک جایگاه جدید N-گلیکوزیلاسیون از طریق جهش­ زایی هدفمند مبتنی بر PCR و تبدیل کدون اسیدآمینه آرژینین شماره ۳۷ به آسپاراژین ایجاد شد. توالی رمز کنندۀ فرم جهش یافته فاکتور ۹  انسانی بطور موازی با توالی طبیعی (به عنوان کنترل)، در وکتور بیانی pCEP۴ مجهز به پروموتر ویروس سایتومگالو (CMV)، همسانه سازی شده و بیان آنها در سلول­های HEK۲۹۳ مورد بررسی قرار گرفت. به منظور بررسی رخداد هایپرگلیکوزیلاسیون در نوع جهش یافته، از روش گرادیان SDS-PAGE دارای شیب غلظت آکریل­آمید و به دنبال آن وسترن بلاتینگ استفاده شد که نشان دهنده سنگین­تر بودن محصول جهش یافته نسبت به فرم طبیعی بود. همچنین پس از هضم با استفاده از آنزیم PNGase هر دو محصول طبیعی و جهش یافته وزن مولکولی یکسانی کسب کردند. این نتایج نشان داد که افزایش وزن مولکولی پروتئین جهش یافته ناشی از اضافه شدن گلیکن جدید بوده و تایید کننده رخداد هایپرگلیکوزیلاسیون است.
 

---

با توجه به نقش مهم آنزیم­ها در تسهیل عملکرد فرایند­های مختلف، استفاده از آن­ها در اغلب صنایع  بسیار مورد توجه است. درصد بسیار پایینی از میکروارگانیسم­های تولید کننده­ی آنزیم­های جدید در محیط آزمایشگاهی قابل کشت می­باشند، این درحالی است که متاژنوم منبع عظیمی از اطلاعات ژنتیکی آنزیم­های ناشناخته را می­تواند در اختیار ما قرار دهد. با توجه به اهمیت استفاده از آنزیم­ها در صنایع گوناگون، آنزیم­هایی با ساختار پایدار و مقاوم در برابر حرارت، کاربرد و عملکرد بهتری را نشان می­دهند و تحقیقات زیادی در زمینه­ی شناسایی و تولید آن­ها به صورت پیوسته صورت گرفته است.
در این پژوهش با استفاده از روش­های محاسباتی، پیشگویی تعیین ساختار و استفاده از توالی آنزیم­های زایلاناز مستخرج از داده­های متاژنوم شکمبه­ی گوسفند، آنزیم زایلانازی با ساختار بسیار مقاوم  شناسایی و به صورت نوترکیب تولید شد. آنزیم زایلاناز نوترکیب مقاوم به حرارت، PersiXyn۵ نام­­گذاری شده و از DNA استخراج شده از محتویات شکمبه گوسفند کلون و در باکتری E.coli بیان و خالص گردید. فعالیت ویژه و پارامترهای کینتیکی K_m و V_max برای این آنزیم محاسبه شده و فعالیت بهینه این آنزیم در دمای ۸۰ درجه سانتی­گراد و pH ۸ مشاهده شد. آنزیم زایلاناز نوترکیب جدید پس از ۲ ساعت تیمار در دمای ۹۰ درجه سانتی­گراد ۵۸ درصد فعالیت خود را حفظ کرد. با توجه به اینکه آنزیم زایلاناز مورد مطالعه مقاوم در دمای بالا و فعال در محیط قلیایی است برای استفاده در صنایع کاغذسازی، تهیه­ی خوراک طیور و تولید سوخت زیستی مناسب می­باشد.

---

 اکتیوین A یکی از اعضای خانواده‌ی فاکتور رشد تغییردهنده‌ی بتا (TGF-β) است که نقش مهمی در فرآیندهای فیزیولوژیکی متعدد همانند تمایز سلولی، ترمیم بافتی، رگ زایی، تمایز سلول های بنیادی، چسبندگی سلولی و آپوپتوز دارد. لذا با توجه به کاربردهای بالینی متعدد این پروتئین، تولید نوترکیب آن سودمند می‌باشد.از آنجاییکه اشرشیاکلی یکی از محبوب ترین میزبان ها برای تولید پروتئین‌های نوترکیب است، در این تحقیق از بیان سیتوپلاسمی در این سویه به منظور تولید مقادیر بالایی از اکتیوین A استفاده گردید. بدین منظورابتدا cDNA ناحیه‌ی بالغ ژن اکتیوین A  تکثیر و در وکتور (+)pET۲۸a کلون گردید. وکتور حاصل به سویه‎های (DE۳)BL۲۱،  plysS(DE۳)BL۲۱ و  Rosetta gami (DE۳)BL۲۱ انتقال داده شد. پس از القای پروموتر با استفاده از IPTG و بیان پروتئین، تولید  اکتیوین A  به وسیله‌ی روش های SDS-PAGE و وسترن بلات تایید شد. نتایج نشان داد که بیان اکتیوین A در سیتوپلاسم هر سه سویه یک رویکرد موثر برای دست‌یابی به میزان بالایی از پروتئین نوترکیب است اما در این بین، سویه (DE۳)BL۲۱ مقدار بیشتری پروتئین تولید کرده است. در مرحله ی بعد به منظور دست یابی به شکل محلول اکتیوین A از بیان همزمان چپرون‌های سیتوپلاسمی TF، GroEL/ES و DnaK/J  با وکتور (+)pET۲۸a که حامل اکتیوینA بود استفاده شد. نتایج SDS-PAGE و وسترن بلات نشان داد که بیان همزمان اکتیوین A با استفاده از پلاسمید چپرونی pGro۷ که دارای چپرون های GroEL و GroES می‌باشد، در سویه‌ی(DE۳)BL۲۱ یک رویکرد مؤثر برای تولید پروتئین اکتیوین A محلول است.

---

فاکتور رشد عصبی (NGF) یک فاکتور نوروتروفیک عصبی می­ باشد که در حفظ، بقاء و تمایز سلول­های عصبی مرکزی و محیطی فعالیت دارد. این پروتئین سه زیرواحدی بوده که زیرواحد بتای آن دارای فعالیت اصلی است. براساس تحقیقات، به نظر می­رسد که می­توان از این فاکتور در درمان بسیاری از بیماری­ها از جمله نوروپاتی­­های محیطی در ارتباط با دیابت، آلزایمر، پارکینسون، بیماری­های پوستی و غیره استفاده کرد. به دلیل فضای اکسیداتیو پری پلاسم، بیان پروتئین نوترکیب NGF در میزبان پروکاریوتی باید در پری­ پلاسم صورت گیرد. شایان ذکر است که بیان هم­زمان چپرون­های سیتوپلاسمی، می تواند ترشح پروتئین­های نوترکیب به فضای پری­پلاسمی را تسهیل کرده و سبب افزایش حلالیت آن­ها ­شود.
در این تحقیق تاثیر چپرون های سیتوپلاسمی GroEL/GroES، DnaK/DnaJ،GrpE ، Trigger Factor(TF) بر میزان تولید پری پلاسمی پروتئین نوترکیب NGF مطالعه گردید. بدین منظور زیرواحدβ-NGF  در وکتور بیانی pET۳۹b(+) بصورت هم­زمان با پلاسمیدهای چپرونی pG-Tf۲، pTf۱۶، pGro۷،pKJE۷  و pG-KJE۸ در باکتری E. coli سویه DE۳  بیان شد.
نتایج بدست­ آمده نشان دادند که در حضور چپرون ) TFپلاسمید چپرونی pTf۱۶ ) تولید کل محتوای پروتئینی و پروتئین های پری­ پلاسمی افزایش داشته ­است. همچنین مجموع چپرون های DnaK/DnaJ و  GroEL/GroES(پلاسمید چپرونی pG-KJE۸ ) نیز تا حدودی سبب افزایش تولید شده اند، در حالی­که بیان هر یک از چپرون های GroEL/GroES(پلاسمید چپرونی pGro۷) و یا DnaK/DnaJ (پلاسمید چپرونیpKJE۷) تأثیری بر بیان پروتئین نداشته اند. نتایج کشت سلول نیز نشان دهنده فعال بودن پروتئین تولیدی بوده و تمایز سلول ها به سلول­های عصبی را نشان می دهد.

---

هدف: پروتئازها از مهم­ترین آنزیم­های صنعتی محسوب می­شوند. معمولاً برای تولید این آنزیم­ها از باکتری­های جنس باسیلوس استفاده می­شود. هدف از این پژوهش همسانه­سازی، تعیین توالی، بیان و بررسی بیوانفورماتیکی ژن سرین پروتئاز aprX استخراج شده از باکتری باسیلوس لیکنی­فورمیس بود.
مواد و روش­ها: پس از استخراج DNA باکتریایی، ژن سرین پروتئاز با نام aprX از باکتری Bacillus licheniformis جداسازی و در ناقل pTG۱۹-T  و سپس ناقل pET۲۸a(+) همسانه­سازی شد و ساختار مولکولی، ویژگی­های بیوشیمیایی و فیلوژنتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت و ساختار سه بعدی آنزیم همسانه­سازی شده پیش­بینی شد. جهت القای بیان ژن نوترکیب سرین پروتئاز از القاگر IPTG استفاده گردید و بیان پروتئین در غلظت­های مختلف IPTG، دماهای مختلف و زمان­های گوناگون مورد بررسی قرار گفت. تأیید بیان ژن aprX توسط آنالیز SDS-PAGE و دات بلاتینگ انجام شد. در ادامه نیز فعالیت آنزیم پروتئاز نوترکیب در دما و pH های گوناگون مورد سنجش قرار گفت.
یافته­ها: درستی همسانه­سازی به وسیله توالی­یابی تأیید شد. بر اساس نتایج حاصل از بررسی­های فیلوژنتیکی، توالی پروتئینی به دست آمده شباهت زیادی را با توالی­های سایر باسیلوس­ها نشان داد. پس از ارزیابی مدل­ها مشخص گردید که مدل­های ارائه شده توسط نرم­افزارهای RAPTORX و I-TASSER مدل­های مطلوبی برای پیش­بینی ساختار سه بعدی این پروتئاز هستند. تولید پروتئین نوترکیب با القاء IPTG به میزبان حاوی پلاسمید pET۲۸a-aprX با موفقیت انجام شد. بیشترین مقادیر بیان پروتئین نوترکیب در دمای ۲۵ درجه و طی زمان ۲۰ ساعت و با IPTG ۵/۰ میلی­مولار به‏دست آمد.

---

هدف: ویروس آنفلوانزای A (H۱N۱) از مهم‏ترین زیرگونه‏های ویروس آنفولانزاست که منجر به پیامدهای متعددی در جهان شده است. هماگلوتینین یکی از مهم‏ترین آنتی‏ژن‏های این ویروس می‏باشد که باعث ایجاد پاسخ ایمنی می‏شود. اتصال این پروتئین به گیرنده‏های سلول میزبان منجر به شروع فرایند بیماری‏زایی می‏شود. با توجه به نقش حیاتی مرحله اتصال ویروسی، این پژوهش درصدد استخراج و جای‏سازی ژن هماگلوتینین و زیرواحد بزرگ آن (HA۱) با هدف تولید شاتل ناقل نوترکیب باکیولوویروس (بکمید) برای تولید پروتئین نوترکیب در سلول‏های حشره است. مواد و روش‏ها: ویروس آنفلوانزای انسانی A/New Caledonia ۹۹/۲۰/(H۱N۱) در کشت سلولی MDCK تکثیر شده و RNA کامل ویروسی توسط محلول Easy–red تخلیص شد. سپس طول کامل ژن هماگلوتینین و ژن HA۱ توسط روش RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی تکثیر و ابتدا در ناقل pGEM-TEasy و سپس در پلاسمید pFastBac HT جای‏سازی شد. در نهایت بکمید نوترکیب واجد ژن‏های فوق در سلول‏های میزبان DH۱۰Bac تولید شد. نتایج: محصولات PCR ژن هماگلوتینین با الکتروفورز روی ژل آگارز و هضم با آنزیم‏های محدودالاثر ارزیابی شد. ناقل نوترکیب pGEM-Teasy و پلاسمید دهنده نوترکیب pFastBac HT توسط روش PCR، هضم آنزیمی و تعیین ترادف تأیید شد. تولید DNA نوترکیب بکمیدی نیز توسط افتراق کلونی‏های آبی-سفید، الکتروفورز روی ژل آگارز ۷/۰ درصد، PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و آغازگرهای pUC/M۱۳ مورد تأیید قرار گرفت. نتیجه‏گیری: در این پژوهش، بکمید نوترکیب واجد ژن هماگلوتینین و زیرواحد بزرگ آن با موفقیت ساخته شد. در ادامه سلول‏های حشرات به‏منظور تولید باکیولوویروس نوترکیب با سازه‏های فوق ترانسفکت شده و پروتئین‏های نوترکیب برای مطالعات آتی تولید خواهد شد.

---

باکتری اشرشیاکلی یکی از مهمترین میزبان ­های مورد استفاده برای تولید پروتئین نوترکیب می ­باشد. به عنوان مثال، بیشتر پروتئین­ های دارویی که توسط سازمان غذا و داروی  آمریکا جهت مصرف مورد تایید قرار گرفته ­اند در اشرشیاکلی تولید شده اند. یکی از مزیت­ هایی که این موجود را به یک کارخانه مناسب جهت تولید پروتئین­های نوترکیب تبدیل کرده، شناخت کامل ماهیت زیستی آن می­ باشد. این امر سبب شده است که در سال­ های اخیر امکان ایجاد تغییرات جهت دار برای مبدل ساختن این کارخانه کوچک به سامانه­ ای هوشمند برای ساخت آسان­تر انواع پروتئین ­های نوترکیب با ویژگی­ های گوناگون فراهم شود. به طوری که هم اکنون سویه­ های مهندسی شده­ ی مختلف و بسیار پرکاربردی برای تولید مقدار بالا و پایدار پروتئین­ های مورد نظر از سویه­ های والد و وحشی به دست آمده است که در آزمایشگاه و صنعت قابل استفاده می­ باشد. در این مقاله مروری ما به معرفی تعدادی از این سویه­ ها که پرکاربردتر هستند می­ پردازیم.

---

هدف: BMP-۷ عامل رشد چند منظوره‏ای است که اغلب به دلیل خواص استخوان‏زایی خود شناخته شده است. به دلیل قیمت بالا، دسترسی به این پروتئین برای مصارف درمانی محدود است. تاکنون تولید هترولوگ پروتئین نوترکیب BMP-۷ در تعدادی از سیستم‏های بیانی انجام یافته است. در مطالعه حاضر شکل جدیدی از پروتئین در میزبان‏های پروکاریوتی و یوکاریوتی بیان شده است. مواد و روش‏ها: برای بیان در سیستم بیانی پروکاریوتی، پروتئین جدید به فضای پری‏پلاسمی باکتری اشریشیا کلی ترشح شد و تخلیص توسط ستون تمایلی انجام گرفت. برای بیان در سیستم بیانی یوکاریوتی، قطعه cDNA با طول کامل به سلول یوکاریوتی CHO منتقل شد و کلون‏های پایدار انتخاب شد. بیان پروتئین نوترکیب در هر دو سیستم بیانی توسط آزمون وسترن بلات تأیید شد. نتایج: پروتئین نوترکیب جدید به صورت دایمر با وزن مولکولی ۳۶-۳۸ کیلودالتون در سلول یوکاریوتی و به صورت مونومر با وزن مولکولی ۱۶ کیلودالتون در سیستم بیانی اشریشیا کلی تولید شد. تجزیه و تحلیل کمّی با استفاده از الایزا نشان داد که سطح بیان جهش یافته در سیستم بیانی یوکاریوتی و پروکاریوتی به ترتیب ۴۰ و ۱۳۵ نانوگرم در هر میلی‏لیتر از محیط کشت است. نتیجه‏گیری: در این مطالعه سطح بیان پروتئین در اشریشیا کلی حداقل ۳ برابر میزان بیان در سلول یوکاریوتی بود. با این وجود بهینه‏سازی‏های بیشتر برای به‏دست آوردن مولکول دایمر در اشریشیا کلی مورد نیاز است. نتایج مطالعه مذکور نشان داد که بیان پری‏پلاسمی ممکن است برای تولید پروتئین‏های پیچیده مانند BMPs مناسب باشد.

---

مقدمه: پپتید آمیلوئید ‌بتا (Aβ) علت اصلی تشکیل پلاگ‌های سمی در بیماران آلزایمری می‌باشد. به‌همین علت، مطالعه بر روی این پپتید و شناخت مکانیسم‌های مولکولی و سلولی مرتبط آن، در تشخیص و درمان بیماری ضروری است. پژوهش حاضر یک روش سریع، آسان و ارزان برای تولید و خالص‌سازی این پپتید ارائه داده که بر اساس بیان ژن Aβدر سیستم باکتریایی است.

مواد و روش‌ها: ژن Aβسنتز و به وکتور بیانی pET۲۶b انتقال یافت. پس‌از القا با لاکتوز و انکوباسیون ۲۴‌ساعته جهت بیان پپتید، رسوب سلولی حاصل به منظور بررسی و تایید وجود پپتید نوترکیب بوسیله SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی گردید. سپس خالص‌سازی پپتید نوترکیب با روش کروماتوگرافی تمایلی ستون Ni-NTA صورت گرفت. تعیین ویژگی کشندگی سلولی Aβخالص، در غلظت های  µM ۲۵  و  µM ۵۰ با استفاده از آزمون MTT  بر روی لاین سلولی مدل آلزایمر(SH-SY۵Y) انجام شد.
نتایج: نتایج PCR Colony و تعیین‌توالی تاییدکننده ورود صحیح قطعه بیان‌کننده Aβبه داخل وکتور بیانی می باشد. بررسی طول باندها در SDS PAGE و وسترن بلات، نمایانگر بیان موفقیت‌آمیز پپتید نوترکیب حاوی دنباله هیستیدینی می‌باشد. در نهایت نتیجه آزمون MTT نشان داد که پپتید خالص‌شده در غلظت‌های µM۲۵  و  µM۵۰ به‌ترتیب دارای کشندگی ۳۰ و ۵۰ درصدی است.
بحث: تولید پپتید آمیلوئید ‌بتا در میزبان‌های باکتریایی بسیار مطلوب به‌نظر می‌رسد. همچنین به‌دست‌آوردن پپتید Aβخالص به صورت محلول یک مزیت مهم این تحقیق می‌باشد. با توجه به عملکرد کشندگی پپتید خالص‌شده، میتوان از آن برای تیمار سلول‌های مدل و انجام مطالعات پیرامون آلزایمر استفاده نمود.