---

چکیده:
زمینه: ویروس آنفولانزا تیپ Aدارای ژنومRNA با قطبیت منفی می باشد که از ۸ رشته تشکیل شده است که برحسب نوع ویروس کد گذاری میکند برای ۱۲-۱۴ پروتیین. تغییرات ژنتیکی این ویروس باعث بروز اپیدمی های جدید در سرتاسر دنیا در بین انسان ها می شود. از این رو وجود یک روش دقیق و سریع به منظور تشخیص سویه های جدیدضروری می باشد.این مطالعه با هدف تشخیص سریع زیر تیپ های جدید ویروس آنفولانزای A با به کارگیری روش RT-PCRاختصاصی بر اساس ژن هماگلوتینین انجام شد.
روش کار: در این مطالعه ۳۰ نمونه ترشحات دستگاه تنفسی بیماران مبتلا به آنفولانزا در تخم مرغ جنین دار کشت داده شد سپس RNA استخراج، cDNA تهیه و واکنش PCRبا استفاده از جفت پرایمرهای اختصاصی طراحی شده از ژن هماگلوتینین انجام شد. محصول PCR، پس ازتخلیص تعیین توالی گردید.
یافته ها: مقایسه توالی نوکلئوتیدهای محصول PCR باتوالی موجود در بانک ژنی نشان داد که توالی نمونه های مثبت جدا شده از بیماران با توالی سویه های جدید جدا شده در سالهای اخیر شباهت بالایی دارند، در نتیجه RT-PCR استفاده شده در این مطالعه کاملا اختصاصی بوده و قادر به تکثیر و تشخیص آنفولانزا A و زیر گروه های آن از نمونه های کلینیکی می باشد.

نتیجه گیری: نتایج این مطالعه تایید می کند که PCR بر اساس ژن هماگلوتینین به همراه تعیین توالی یک روش حساس و اختصاصی برای تشخیص سریع ویروس آنفولانزای تیپ A و زیرتیپ های جدید آن مستقیما از نمونه های کلینیکی می باشد که برای تهیه وتولید واکسن سودمنداست.

---

هدف: ویروس آنفلوانزای A (H۱N۱) از مهم‏ترین زیرگونه‏های ویروس آنفولانزاست که منجر به پیامدهای متعددی در جهان شده است. هماگلوتینین یکی از مهم‏ترین آنتی‏ژن‏های این ویروس می‏باشد که باعث ایجاد پاسخ ایمنی می‏شود. اتصال این پروتئین به گیرنده‏های سلول میزبان منجر به شروع فرایند بیماری‏زایی می‏شود. با توجه به نقش حیاتی مرحله اتصال ویروسی، این پژوهش درصدد استخراج و جای‏سازی ژن هماگلوتینین و زیرواحد بزرگ آن (HA۱) با هدف تولید شاتل ناقل نوترکیب باکیولوویروس (بکمید) برای تولید پروتئین نوترکیب در سلول‏های حشره است. مواد و روش‏ها: ویروس آنفلوانزای انسانی A/New Caledonia ۹۹/۲۰/(H۱N۱) در کشت سلولی MDCK تکثیر شده و RNA کامل ویروسی توسط محلول Easy–red تخلیص شد. سپس طول کامل ژن هماگلوتینین و ژن HA۱ توسط روش RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی تکثیر و ابتدا در ناقل pGEM-TEasy و سپس در پلاسمید pFastBac HT جای‏سازی شد. در نهایت بکمید نوترکیب واجد ژن‏های فوق در سلول‏های میزبان DH۱۰Bac تولید شد. نتایج: محصولات PCR ژن هماگلوتینین با الکتروفورز روی ژل آگارز و هضم با آنزیم‏های محدودالاثر ارزیابی شد. ناقل نوترکیب pGEM-Teasy و پلاسمید دهنده نوترکیب pFastBac HT توسط روش PCR، هضم آنزیمی و تعیین ترادف تأیید شد. تولید DNA نوترکیب بکمیدی نیز توسط افتراق کلونی‏های آبی-سفید، الکتروفورز روی ژل آگارز ۷/۰ درصد، PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و آغازگرهای pUC/M۱۳ مورد تأیید قرار گرفت. نتیجه‏گیری: در این پژوهش، بکمید نوترکیب واجد ژن هماگلوتینین و زیرواحد بزرگ آن با موفقیت ساخته شد. در ادامه سلول‏های حشرات به‏منظور تولید باکیولوویروس نوترکیب با سازه‏های فوق ترانسفکت شده و پروتئین‏های نوترکیب برای مطالعات آتی تولید خواهد شد.